클라미디아 트라코마티스에서 발달 돌연변이를 식별하고 격리하는 살아있는 세포 앞으로 유전 적 접근
Summary
이 프로토콜은 클라미디아 트라코마티스의발달 돌연변이를 식별하고 격리하기 위해 방향유전 적 접근법에서 형광 프로모터 기자, 살아있는 세포 현미경 검사법 및 개별 포괄 추출을 활용합니다.
Abstract
세포 내 세균성 병원체 클라미디아 트라코마티스는 두 가지 형태학적으로 이산적 발달 형태로 구성된 발달 주기를 겪는다. 비 복제 초등체 (EB)는 호스트의 감염을 시작합니다. 일단 내부에, EB는 망상 몸으로 분화 (RB). 그런 다음 RB는 전염성 EB 양식으로 다시 분화하기 전에 여러 차례의 복제를 수행합니다. 이 주기는 세포 모형 사이를 전환하는 실패가 호스트 침입 또는 복제를 방지하기 때문에 클라미홈 생존을 위해 필수적입니다.
클라미디아의 의무적인 세포 내 특성으로 인한 유전 적 기술의 한계는 세포 형 발달에 관여하는 분자 메커니즘의 식별을 방해했습니다. 우리는 살아있는 세포 현미경 검사법과 함께, 실시간으로 세포 형 전환의 시각화를 허용하는 새로운 이중 프로모터 기자 플라스미드 시스템을 설계했습니다. 세포형 발달의 조절에 관여하는 유전자를 확인하기 위해, 살아있는 세포 프로모터-리포터 시스템은 이중 리포터 균주의 화학돌연변이발생, 클라미디아의 화상 진찰 및 추적을 변경된 발달 운동과 결합하여 돌연변이체의 클로나 탈린을 결합하여 전진 유전적 접근법의 발달을 위해 활용되었다. 이 전진 유전 워크플로우는 광범위한 유전 적 경로로 지시 된 심문을 위해 수정 할 수있는 유연한 도구입니다.
Introduction
클라미디아 트라코마티스(Ctr)는 생존과 증식1에필수적인 이중협발달주기를 통해 진행되는 의무적인 세포내 병원체이다. 이 주기는 두 가지 발달 형태, 초등체 (EB) 및 망상 체체 (RB)로 구성됩니다. EB는 복제 무능하지만 이펙터 유도 내분비증2를통해 세포 침입을 중재한다. 호스트에 도착하면 EB는 복제 RB로 성숙합니다. RB는 후속 감염 라운드를 시작하기 위해 EB로 다시 변환하기 전에 여러 복제를 수행합니다.
유전 공구의 제한된 배열은 생화학 연구 또는 대리 시스템의 사용에 클라미다이얼 연구의 대부분을 제한했습니다. 그 결과, 유전자 조절및 발달주기의 제어의 해명성은3,,4. 클라미얼 필드에서 더 중요한 도전 의 한은 클라미온 발달 주기의 고해상도 측량 추적 및 그것의 규칙에 관련된 단백질의 식별입니다. 클라미온 발달 주기 동안 유전자 발현은 전통적으로 RNAeq, qPCR 및 고정 세포 현미경 검사법을 포함하는 파괴적인 “종점” 방법에 의해 수행되어 왔다5,,6. 이러한 방법은 귀중한 정보를 제공했지만, 사용되는 기술은 힘들고 낮은 시간적 해상도5,,6을가지고 있다.
지난 10년 동안 Ctr의 유전자 조작은 플라스미드 변환 및 돌연변이 발생에 대한 방법의 도입으로 진행되었습니다77,8,,9. 이 연구를 위해, 플라스미드 기반 시스템은 감염의 과정을 통해 실시간으로 개별 포함에 있는 클라미다이얼 발달을 감시하기 위하여 개발되었습니다. RB 및 EB 세포 형 특정 프로모터 리포터를 모두 표현한 클라미타임 트랜스포메이션이 만들어졌습니다. RB 특이기자는 형광 단백질 클로버의 초기 RB 유전자 유오 상류의 프로모터를 융합시킴으로써 구성되었다. EUO는 후기 EB 관련 유전자10의하위 집합을 억압하는 전사 레귤레이터입니다. EB 핵응축에 관여하는 히스톤과 같은 단백질을 인코딩하는 hctB의발기인은 EB특이기자(11)를만들기 위해 mKate2(RFP)의 상류로 직접 복제되었다. hctB무도m-mKate2/euoeuo무도회-클로버의 백본은 p2TK2SW27이었다. hctB및 euo 프로모터는 Ctr-L2 게놈 DNA로부터 증폭되었다. 각 프로모터 서열은 지정된 클라미다이얼 유전자에 대한 예측된 전사 시작 부위의 상류 ~100개의 염기 쌍과 각각의 ORF의 첫 30뉴클레오티드(10개의 아미노산)로 구성되었다. 형광 FP 변이체는 Ctr codon최적화 유전자 블록으로 상업적으로 얻어지고 각 클라미원 유전자 및 프로모터의 처음 30뉴클레오티드와 함께 프레임에서 복제되었다. incD 종기는 mKate2의 바로 하류로 복제되었습니다. 두 번째 프로모터 리포터는 incD 종기의 하류에 삽입되었습니다. p2TK2SW2의 암피실린 내성유전자(bla)는pBam4로부터 aadA 유전자(Spectinomycin 저항)로 대체되었다. 이로 인해 Ctr-L27로변형된 최종 구조 p2TK2-hctB 무도회-mKate2/euo 무도회-클로버(그림1A)가그 결과.hctBeuo 이러한 RB/EB 리포터 균주는 살아있는 세포 현미경검사(도1B, C)를사용하여 단일 내의 발달 주기의 관찰을 허용했다.
화학 돌연변이 발생과 함께 우리의 발기인 기자 구조를 채택, 프로토콜추적하고 Ctr 세로바르 L2의 돌연변이 인구에서 개발 이상을 나타내는 개별 클론을 분리하기 위해 고안되었다. 이 프로토콜은 개별 클라미다이얼 포함의 직접적인 감시를 허용하고, 시간이 지남에 따라 유전자 발현 프로파일의 추적, 변경된 발달 유전자 발현 패턴을 표현하는 클라미얼 클론을 식별하고, 개별 적인 포함에서 클라미디아의 클로나 절연을 확인합니다.
이 프로토콜은 클라미원 발달에 관여하는 유전자의 확인을 위해 특별히 만들어졌지만, 클라미온 유전 경로의 수를 심문하기 위해 쉽게 적응될 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
클라미온 발달 주기를 제어하는 메커니즘을 해부하는 것은 현재 사용 가능한 유전 도구의 한계에 의해 방해되었습니다. 우리의 프로모터 기자 클라미디아를 사용하여 살아있는 세포 자동화 현미경 검사법과 함께, 24 시간 동안 개별 포함에 세포 형 발달의 모니터링을 가능하게 하는 시스템이 만들어졌습니다. 이러한 시스템은 화학돌연변이발생 및 직접 포괄 분리와 함께 변경된 발달<strong …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 CIP-1 도끼 미디어를 공급 워싱턴 주립 대학의 앤더스 옴슬랜드 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01AI130072, R21AI135691 및 R21AI13617에 의해 지원되었다. 추가 지원은 아이다호 대학과 NIH 보조금 P20GM104420을 통해 복잡한 상호 작용을 모델링하기위한 센터에서 시작 기금에 의해 제공되었다.
Materials
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
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