כתב היד מציג באתר דגימה של גידולים במוח האנושי עם מיקרו-ארכה שלב מוצק ואחריו פרופיל ביוכימי שלהם לקראת גילוי סמנים ביולוגיים.
למרות מגוון הכלים הזמינים לאבחון סרטן סיווג, שיטות המאפשרות אפיון מהיר ופשוט של גידולים עדיין בצורך. בשנים האחרונות, ספקטרומטריית מסה הפכה לשיטת בחירה עבור פרופיל לא מרוסן של תרכובת מפלה כמו סמנים ביולוגיים פוטנציאליים של מחלה. Biofluids נחשבים בדרך כלל מטריצות עדיפות בהתחשב בנגישות שלהם עיבוד מדגם קל יותר בעוד פרופיל רקמות ישירות מספק מידע סלקטיבי יותר על סרטן נתון. הכנת רקמות לניתוח בשיטות מסורתיות היא הרבה יותר מורכבת וגוזלת זמן, ולכן, לא מתאימה לניתוח מהיר באתר. העבודה הנוכחית מציגה פרוטוקול המשלב הכנה מדגם וחילוץ של מולקולות קטנות באתר, מיד לאחר ניתוח הגידול. מכשיר הדגימה, שהוא בגודל של מחט דיקור סיני, ניתן להכניס ישירות לתוך הרקמה ולאחר מכן מועבר למעבדה הסמוכה לניתוח אינסטרומנטלי. התוצאות של ניתוחי מטבולומיקה וליפידומיקה מדגימים את היכולת של הגישה להקמת פנוטיפים של גידולים הקשורים למקור היסטולוגי של הגידול, ממאירות, מוטציות גנטיות, כמו גם עבור הבחירה של תרכובות מפלות או סמנים ביולוגיים פוטנציאליים. האופי הלא הרסני של הטכניקה מאפשר ביצועים עוקבים של בדיקות בשימוש שגרתי למשל, בדיקות היסטולוגיות, על אותן דגימות המשמשות לניתוח SPME, ובכך מאפשר השגת מידע מקיף יותר כדי לתמוך באבחון מותאם אישית.
הדמיית תהודה מגנטית (MRI) וטומוגרפיה ממוחשבת (CT) הן השיטות העיקריות המשמשות לניתוח בזמן אמת של נגעים במוח. בידול גידול במוח מבוסס בדרך כלל על היסטופתולוגיה עם כתמים נוספים וטכניקות אימונוהיסטוכימיות מתקדמות. על פי ההנחיות המעודכנות על גידולים במוח העצבים המרכזי שהונפקו על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) בשנת 2016, בדיקות גנטיות הן קריטיות עבור בידול סיווג של גידולים אלה1. בידול סיווג של גידולים מאפשרים לרופאים לבחור את הטיפול היעיל ביותר עבור סוג נתון של גידול ובכך להרחיב את תוחלת החיים של המטופל. למרבה הצער, למרות הזמינות של שיטות מתקדמות כאלה כדי לסייע לרופאים בבחירת טיפול אופטימלי עבור המטופלים שלהם, תוחלת החיים של חולים שאובחנו עם גליובלסטומה (GLIOMA כיתה IV) הוא רק על 15-16 חודשים2. גם עם התחכום והדיוק המוגבר של שיטות ההדמיה וההיסטולוגיות אמר ככלי אבחון, עדיין יש צורך גדול בטכניקות חדשות המסוגלות להציע מידע משלים כדי לסייע לרופאים בהחלטות לגבי מהלך הטיפול. במהלך השנים האחרונות, מספר גישות חדשות המבוססות על ספקטרומטריה המונית הוצעו לניתוח תוך-ניתוחי שלסרטן 3,4. הפוטנציאל של מיקרו-התרחבות שלב מוצק (SPME), השיטה המוצגת בכאן, ככלי ניתוח מהיר באתר, כבר הוכח במגוון מחקרים5. כתב היד הנוכחי מראה את אחד היישומים הקליניים של השיטה, מטבולומיקה לא מנויעית וליפידומיקה של גידולים במוח האנושי. חקירות לא מוגדרות מציגות נקודת התחלה חשובה בגילוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים. לאחר הקמתו, סמנים ביולוגיים כאלה לאחר מכן יכול לשמש הפניות אבחון להבדיל בין גידולים באמצעות אותה טכנולוגיה בשילוב מכשור באתר.
SPME היא טכניקת הכנת מדגם מבוססת שיווי משקל המחלצת מולקולות קטנות מטריצות לדוגמה עם שימוש בכמויות קטנות של שלב החילוץ. בתצורה המסורתית ביותר של SPME של המכשיר (בדיקה), סיבים מצופה בשלב החילוץ המתאים משותק על תמיכה מוצקה כלומר, חוט מתכת5,6. ציפויים והתקנים תואמים ביולוגית (בדיקות) מאפשרים חילוץ ישירות מטריצות ביולוגיות מורכבות ללא טיפול מקדים לדוגמה, למשל, הומוגניזציה וסינון. באמצעות תהליך החילוץ, אנליטים מחולקים בין שלב החילוץ למטריצה לדוגמה ביחס לריכוזים הראשוניים שלהם. אם החילוץ מתבצע מספיק זמן, אז שיווי משקל מושגת. בעוד החילוץ בשיווי משקל מספק את הרגישות הגבוהה ביותר האפשרית ושחזור, חילוץ טרום שיווי משקל אפשרי גם אפשרי ואפילו עדיף במקרים מסוימים, כלומר, בדגימת vivo, שבו הגבלות זמן הקשורות דגימה באתר (למשל, חדרי הפעלה או מיון) מחייבים עקירות מהירות. פרופיל זמן החילוץ של analyte נתון מושפע בדרך כלל על ידי המאפיינים הפיזיקוכימיים של analyte, המטריצה שנדגמת, סוג סורבנט בשימוש, ומספר תנאי חילוץ אחרים. שפע של גורמים השולטים קינטיקה החילוץ שלהם עושה את זה כמעט בלתי אפשרי להבטיח שאיבת שיווי משקל של כל התרכובות כאשר ניתוחים לא מפוצצים כגון מטבולומיקה או lipidomics מבוצעים. מהסיבות הנ”ל, זמן החילוץ של הפרוטוקול הנוכחי נקבע באופן שרירותי כדי להבטיח רגישות מספקת וכיסוי של מטבוליטים מצד אחד, ומעשיות לשימוש באתר מצד שני.
יודגש כי הגודל הקטן מאוד של בדיקות המשמשות להפקת דגימה מרקמות רק גורם נזק מינימלי לרקמות בעוד הליך הדגימה עצמו אינו צורך רקמה אלא כמויות קטנות מאוד של מולקולות קטנות מהאזור שנדגמו; לכן, אותה מדגם יכול לשמש עוד יותר לבדיקות שגרתיות, כלומר, היסטולוגי או גנטי, המאפשר השגת מידע חיוני ומשלים מאותה מדגם. נתונים משלימים ומקיף כאלה יאפשרו הבנה טובה יותר של ביולוגיה של הגידול, בתקווה להקל על הגילוי של יעדי טיפול חדשים. ניצול שיטה זו מגביר עוד יותר את האפשרות של אבחון תוך-ניתוחי באתר בעת קביעת סמנים ביולוגיים של היעד.
להלן אנו מציגים פרוטוקולים לדגום של גידולים במוח באתר עבור מטבולומיקה וניתוחי lipidomics ועיבוד נתונים.
מטבולומיקה לא ממוקדת וליפידומיקה משמשים בדרך כלל במחקרים המתמקדים בזיהוי סמנים ביולוגיים של גידול. עם זאת, ברוב המקרים, חוקרים מחפשים תרכובות שניתן להשתמש בהם לסינון המחלה. כתוצאה מכך, הדגימות הביולוגיות המועדפות הן דם או שתן בשל הגישה הקלות יחסית שלהם. ניתוח של רקמת הגידול מבוצע בעיקר כדי להבין את המנגנונים מאחורי המחלה, לאפיין סוגי גידולים שונים, וכו ‘. ניתוח באתר של סמנים ביולוגיים גידול מבוצע לעתים נדירות, כמו יישומים כאלה דורשים הכנה מדגם נרחב. לחלופין, אסטרטגיות המבוססות על ניתוח בזמן אמת של פרופילי רקמות ללא בחירה מוקדמת של סמנים ביולוגיים ספציפיים מרוויחים את תשומת הלב שלהקהילה הרפואית 3,4. הפתרון המוצג בזאת מספק פרספקטיבה נוספת על עיבוד רקמות באתר על ידי חשיפת סוג המידע שניתן להשיג באמצעות שיטות כאלה.
השילוב של דגימה, הכנה לדוגמה וחילוץ הופך את SPME ככלי שימושי מאוד לניתוח באתר. יתר על כן, חוסר צריכת רקמות במהלך הדגימה מאפשר שימוש נוסף של אותן דגימות לניתוח סמן ביולוגי ובדיקות שגרתיות (genotyping, ניתוח היסטולוגי), ולכן, הוספת מידע חדש לתוצאות של בדיקות סטנדרטיות. למכשיר הדגימה יש עיצוב פשוט מאוד, הפעולה שלו קלה מאוד, ולא נדרשת הכשרה מיוחדת כדי לבצע את החילוץ עצמו. עם זאת, השגת תוצאות אמינות דורשת הרבה יותר מאשר רק טיפול נכון של התקנים. כדי לבצע כראוי את הניסוי, צריך להבין את תהליך החילוץ, את אופי המדגם, ולהיות מודע לטעויות פוטנציאליות שיכולות להשפיע על הנתונים.
חשוב לשקול את ההטרוגניות של רקמה סרטנית10; גידולים שנדגמו עשויים להכיל חלקים העוברים נמק, ההסתידות, היפוקסיה, וכל אחד מתהליכים אלה ישתקף חילוף החומרים והליבידום שהושגו, ובכך להשפיע על התוצאות. לכן, מומלץ כי דגימה רזולוציה מרחבית להתבצע על ידי החדרת מספר סיבים בחלקים שונים של הרקמה הסרטנית, או לחילופין, כי ציפוי ארוך יותר ישמש כדי לחדור את כל הגידול כדי לקבל מידע ממוצע על הגידול. אם מתבצעת שיטת הדגימה של הרזולוציה המרחבית, ניתן להסכל את הסיבים בממס אחד של דססורציה; זה לא רק יאפשר את השגת המידע הכולל על הגידול, אלא גם להגביר את הרגישות של הניתוח. לחלופין, תפיגת סיבים בודדים לתוך בקבוקונים נפרדים תאפשר חקירות כדי להבין את המגוון הפנימי של הגידול במוח, אשר מורכב הליבה בנוי של תאים סרטניים, ואת האזור החוץ, שהוא הגבול של רקמה בריאה. חלקים עמוקים יותר של הגידול נפגעים בדרך כלל יותר על ידי התהליכים הקשוריםלסרטן 11. עם זאת, על החוקרים לזכור כי אפשרות זו פוגעת ברגישות השיטה ובמספר הכולל של תרכובות הניתנות לזיהוי. בעבודה הנוכחית, ציפוי 7 מ”מ שימש; אורך זה נחשב אופטימלי עבור גדלים שונים של גידולים הכלולים במחקר. הציפויים חדרו לגידולים, ובכך סיפקו רזולוציה לא מיוחדת, אבל נתונים ממוצעים על פני המדגם. ללא קשר לפרוטוקול שנבחר, חשוב שאותו פרוטוקול יבוצעו במהלך המחקר כולו, כולל מספר הסיבים המשמשים לדגום פרטני, אורך הציפוי, זמן החילוץ וכל הגורמים האחרים המוסמרים בעבודה זו.
חשוב לשלוט באיכות הניתוח. יש להכין את ה- QC האוסף (ראה שלבים 4.7 ו- 7.7 בפרוטוקול) ולהשתמש בו לניטור יציבות המכשירים במהלך הפעלת האצווה לדוגמה כולה. הפקדים הריקים (ראה שלב 2.8) יכולים לשמש מאוחר יותר להכנת “רשימת אי-הכללה” כדי למנוע אותות של מזהמים שמקורם בממיסים או בייצור סיבים. במקרים מיוחדים, כגון סיכון לזיהום, יש צורך לבצע דגימה מכפפות, שולחנות, ציוד או כל משטח אחר שעשוי להוות סיכון לזיהום. במקרים כאלה, הכנת סיבים, זמן החילוץ ונוהלי פקיע זהים לדגימות.
ניתוחים מטבולומיים וליפידומיים מתמקדים כולו מולקולות קטנות (פחות מ 1,500 Da) המופיעים אורגניזם או רכיבים ספציפיים של האורגניזם, כגון איברים ספציפיים, רקמה, נוזלים, תאים, וכו ‘. מטבולומיה וליפידומיקה מציעים תמונה של שינויים ביוכימיים המתרחשים בגוף, ובמקרה של סרטן, הם משלבים מידע הקשור לגנום, היסטולוגיה, וממאירות של הגידול. אלה מדעי omics ליצור קשר בין פיזיולוגיה פנוטיפ כמו מטבוליטים גבוהים יותר בסולם ביוכימי מאשר חלבונים אוגנים 12. על ידי הבנת חילוף החומרים והליפידום של גידולים סרטניים, אנו מתקרבים לגילוי הפנוטיפ בקרב כל -omics מדעים כמו ענפי מחקר אלה מציעים ידע מעמיק יותר של שינויים דינמיים של מולקולות כתגובה של אורגניזמים חיים לגירויים שונים. כפי שמוצג בעבודה זו, הנתונים המתקבלים בדגימה אחת תואמים ההיטולוגיה של הסרטן, מידת הממאירות שלה, והוא משקף שינויים המתרחשים ברמת הגנום. בgliomas, כמו סוג של סרטן עניין במחקר זה, המידע מוסתר בגנום חשוב במיוחד, כמו טיפול מותאם אישית מפותח בהתבסס על התוצאות של בדיקות גנטיות. מוטציות מסוימות הן סמנים פרוגנוסטיים של התוצאות של כימותרפיה או הקרנות. כפי שהוכח כאן, הבחירה של סמנים ביולוגיים המשקפים מוטציה נתונה אפשרית עם האסטרטגיה המוצעת. סמני מוטציה, כמו גם סוגי מתארים נוספים כגון אלה המציינים את מידת הממאירות של הגידול יכול לשמש גם כדי לתמוך בשיטות אבחון שגרתיות.
ביופסיה כימית ex vivo עם השימוש סיבים מיקרו-הפעלה שלב מוצק הוא הצעד הראשון ביישום של השיטה לאבחון תוך-ניתוחי. ניתן לאמץ בקלות את השיטה עבור דגימת vivo ממתינה לאישור מלוחות אתיים מתאימים. במקרים כאלה, עיקור של מכשירי SPME חייב להתבצע על פי נהלי עיקור מקובלים של בית החולים שבו הדגימה היא להתבצע, כלומר, autoclaving או עיקור תחמוצת אתילן. יש לשמור את הסיבים המותנה מראש והמעותים בחבילות אטומות המסומנו בתאריך תפוגת עיקור. חשוב לציין כי אין לנקות סיבים באמצעות פעילי שטח. הליך כזה יכול לגרום לשינויים לא ספציפיים בהרכב סורבנט, ובכך להשפיע על החילוץ של אנליטים. במחקרים המתוארים בזאת, 30 דקות חילוץ תקופת שימש, אבל דוחות אחרים לאמת כי זמנים קצרים יותר יכול להניב תוצאות משביעות רצון במחקרים vivo 13. Huq ואח ‘ הראה כי זמן שיווי משקל analyte מושגת מהר יותר ברקמה, כמו מטריצה מורכבת, מאשר מטריצותפשוטות 14. עם זאת, ניתן לסכן את הרבייה של התוצאות שהושגו בתקופות חילוץ קצרות יותר, כאשר אנליטים נוספים יחולצו בתנאים של שיווי משקל טרום; לכן, יש ליישם בקרת זמן מדויקת.
שני מדעי omics מנוצלים כחלק מעבודה זו יש פוטנציאל מצוין ככלי גילוי סמן ביולוגי. לאחר שנבחרו סמנים ביולוגיים או יוחל מודל כימותרפי, ניתן לפתח וליישם אבחון רפואי המבוסס על קביעת מטבוליטים המשמשים כאתרי יעד באמצעות שיטות החלות על חקירות באתר, כגון גישת SPME המתוארת בעבודה זו, כחלק מאבחון שגרתי.
הפרוטוקול המוצע בכתב היד הנוכחי מתאר כיצד לבצע ניתוחים מטבולומיים וליפידומיים לא מפולצים של רקמת סרטן באמצעות מיקרו-extraction שלב מוצק להקרנה של סמנים ביולוגיים פוטנציאליים. הוא נועד לאפשר חילוץ של תרכובות מייצגות, בידול של גידולים, וזיהוי של תרכובות מפלות המאפיינות סרטן נתון כלומר, סמנים ביולוגיים פוטנציאליים. ניתוחים לא מיועדים עם SPME המתואר במאמר זה מייצגים נקודת התחלה בפיתוח של אבחון תוך-ניתוחי מהיר, שבו פאנל נבחר של תרכובות ניתן לקבוע ללא צורך בסינון של כל התרכובות הנוכחיות במדגימה. לטובת תוצאות אבחון מהיר, בדיקות SPME המשמשות לחילוץ באתר יכול להיות קשור ישירות מכשור אנליטי הממוקם במתקן בית החולים. עקירות פשוטות שבוצעו עם הכנה מדגם מינימלי ואחריו ניתוח ללא כרומטוגרפיה יקצר באופן משמעותי את הזמן הכולל בין שעות לכמה דקות, כפי שתואר כבר עבור ניטור סמים15.
The authors have nothing to disclose.
המחקר נתמך על ידי גרנט הרמוניה 2015/18/M/ST4/00059 ממרכז המדע הלאומי. המחברים רוצים להכיר MilliporeSigma, עסק של Merck KGaA, דרמשטט, גרמניה, לאספקת מכשירי SPME המשמשים בעבודה זו. עסקי מדעי החיים של מרק פועלים כמיליפור סיגמה בארה”ב ובקנדה. כמו כן, המחברים רוצים להודות לתרמו פישר סיינטיפיק על הגישה לספקטרומטר מסה של Q-Exactive Focus.
תרומות המחברים: JB: אופטימיזציה של הכנת מדגם ופרמטרים LC-MS, ביצועים של ניסויי SPME-LC-MS, ניתוח נתונים, ניתוח סטטיסטי ופרשנות נתונים והכנת כתב יד הקשורים לחלק lipidomics; PZG: תיאום וביצועים של רוב הדגימות בבית החולים, אופטימיזציה של פרמטרי דגימה והכנה לדוגמה, ביצועים של ניסויי SPME-LC-MS, ניתוח נתונים, ניתוח סטטיסטי ופרשנות נתונים, הכנת כתב יד הקשורים לחלק מטבולומיה; MG – סיוע באופטימיזציה של הכנת מדגם, שיטת LC-MS וניתוח נתונים הקשורים לחלק lipidomics; KG: ביצועים מפעולה של דגימות SPME ואופטימיזציה של דגימה והכנת דגימה, ניתוח SPME-LC-MS הקשורים לחלק מטבולומיה; KC: ביצועים של מספר דגימות SPME בבית החולים, סיוע באופטימיזציה של דגימה, הכנת מדגם וניתוח נתונים הקשורים לחלק מטבולומיה; KJ: ביצועים של מספר דגימות SPME בבית החולים, סיוע בניתוח lipidomics; DP: ביצועים של הליכים כירורגיים, גיוס של החולים; JF: ביצועים של הליכים כירורגיים, גיוס של חולים; MH: ביצועים של הליכים כירורגיים, תיאום של חלק קליני של המחקר; BB: קונספט, תיאום פיקוח על הפרויקט והכנת כתב יד, ביצוע מספר דגימות
acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9×5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |