Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula

Gli studi hanno dimostrato che il tessuto adiposo marrone (BAT) ha una notevole capacità di dissipare energia. Esistono due tipi di adipociti termogenici con caratteristiche dello sviluppo distinte che esistono sia nei roditori che negli esseri umani: adipociti beige e adipociti bruni classici. Mentre gli adipociti bruni classici si trovano per lo più in depositi BAT interscapitolare, gli adipociti beige emergono sporadicamente nel tessuto adiposo bianco (WAT) in risposta ad alcuni segnali fisiologici, come l’esposizione cronica al freddo, un processo chiamato “marrone” o “sbiancamento”. Attraverso l’uso di immagini avanzate, è ormai chiaro che gli esseri umani adulti hanno depositi sostanziali di UCP1^– BAT, soprattutto nella regione supraclavicolare^1,2,3.4 La quantità di BAT umano adulto è inversamente correlata all’adiposità e può essere aumentata da segnali esterni, come l’esposizione cronica al freddo^5,6 o z3-adrenergic recettore agonista⁷. Il dispendio energetico mediato da BAT può offrire un approccio praticabile per combattere l’obesità.

Fino a poco tempo fa, gli adipociti termogenici sono stati considerati una popolazione omogenea. Tuttavia, studi hanno rivelato l’esistenza di più sottotipi o sottopopolazioni distinti nell’origine dello sviluppo, nell’uso del substrato e nel trascrittoma^8,9,10. Per esempio, un tipo di adipocito beige che utilizza preferibilmente glucosio per la termogenesi, l’adipocito g-beige, è stato recentemente descritto¹⁰. La comprensione incompleta dei tipi di cellule nel tessuto adiposo marrone e beige e la mancanza di marcatori specifici costituiscono una barriera critica allo studio delle loro funzioni biologiche.

I metodi tradizionali per isolare le sottopopolazioni di cellule si basano sull’espressione di pochi geni marcatori noti. I recenti progressi nella genomica a singola cellula consentono l’uso di dati di espressione genica globale di singole cellule per fornire una stima imparziale del numero di sottopopolazioni in un tessuto. L’obiettivo finale di questo protocollo è quello di determinare tutti i sottotipi di tessuto adiposo sotto vari stimoli termogenici ad una risoluzione a cella singola. A differenza di altri tessuti e tipi di cellule, determinare i sottotipi cellulari del tessuto adiposo è difficile a causa della fragilità degli adipociti pieni di lipidi. Questo documento introduce un protocollo robusto per isolare singoli nuclei dal tessuto adiposo per l’applicazione a valle al sequenziamento dello snRNA. È importante sottolineare che la letteratura recente che confronta i set di dati di sequenziamento dell’RNA a nuclei singoli (snRNA-seq) e di sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha rivelato che il snRNA-seq è paragonabile allo scRNA-seq nel rilevamento del tipo di cellula e superiore nella copertura cellulare per un tessuto complesso come il cervello¹¹. Questo protocollo combina un metodo di centrifugazione a gradiente di densità ottimizzato per i tessuti adiposi di Rosen et al.¹² con un passo di “pulizia” nuclei con un MoFlo XDP High Speed Sorter. Come si è visto nei risultati rappresentativi, un’analisi di 7.500 nuclei singoli del tessuto adiposo bruno intersbattiare del topo ha identificato più tipi di cellule all’interno di adipociti bruni apparentemente omogenei. Nel complesso, questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare l’organizzazione a livello tissutale di adipociti e cellule residenti adiposi, l’identificazione di geni marcatori specifici del sottotipo e la fenotipizzazione dello sviluppo di topi adipose-selettivi/transgenici.