Summary

היממה של דרוסופילה מלנוגסטר

Published: June 03, 2020
doi:

Summary

כאן, אנו מפרטים כיצד לסנכרן את דרוסופילה ליום ביולוגי. זהו הצעד הראשון והחשוב ביותר הנחוץ ללימוד מקצבים ביולוגיים ותרונוביולוגיה.

Abstract

כמעט אוניברסלי בין אורגניזמים, מקצבים ביולוגיים לתאם פעילות ביולוגית למסלול של כדור הארץ סביב השמש. כדי לזהות גורמים היוצרים קצב זה ולהבין את הפלטים המתווצרים, נדרשת צורך בהתענות של אורגניזמים מודלים לנקודות זמן ביולוגיות מוגדרות. כאן אנו מפרטים הליך להדרך Drosophila רבים לקצב היממה מוגדר. יתר על כן, אנו מפרטים שלבים לאחר ההתעמלות כדי להכין דגימות עבור immunofluorescence, חומצה גרעין, או ניתוח מבוסס מיצוי חלבון.

Introduction

כמעט לכל האורגניזמים על פני כדור הארץ, מהגדול ביותר ועד לתא יחיד, יש שעון ביולוגי פנימי עם מחזור של יום אחד. זה ידוע בשם השעון הביולוגי (טבע בשנת 1953 על ידי פרנץ Halberg מן המונחים הלטיניים circa = על / בערך ו “מת” = יום)1. למרות שמרכיבים של שעון הליבה ידועים ומנגנוני התפקוד הבסיסיים שלהם מושגים, עדיין יש הרבה מה להבין על איך מקצבים ביולוגיים נשמרים בכל הגוף. חשוב לציין, רגולציה שגויה של מקצבים ביולוגיים קשורה לתוצאות בריאותיות גרועות כולל היווצרות זיכרון לקוי, הפרעות שינה, הפרעה השפעה עונתית, דיכאון, הפרעה דו קוטבית, סוכרת, השמנת יתר, ניוון עצבי,וסרטן 2,,3,,4,5.

Drosophila הוא מודל מבוסס היטב לחקירה של הביולוגיה היממה. ניתן להסבת גנטית וביוכימית, מספרים גדולים מאומנים בקלות (כפי שיהיה מוצג). למעשה, כל שבעת הפרסומים שצוטטו כפרסומים מרכזיים של תמיכה בהענקת פרס נובל לגילוי מקצבים ביולוגיים מינפו את החוזקות הללו שלדרוסופילה מודל 6,,7,,8,,9,,10,,11,,12.

בנוסף, אנו מציגים אסטרטגיות יעילות לאיסוף זבובים מאולפים למטרות של אימון מלוד, חומצה גרעין, או ניתוח מבוסס מיצוי חלבונים. באמצעות אסטרטגיות אלה, ניתן לעבד ולאחסן כמויות גדולות יותר של דגימות לניתוח בעתיד. שיטות אלה הן יתרון מאוד בכך שהם לשחזור יכול להניב מאות זבובים מיומנים שיכולים להיות חלק מ מאגר נתונים גדול.

Protocol

1. פליי ייצור מזון לכל 1 L של מים, להכין מזון זבובים המורכב 4.69 גרם של מולסה מיובשת, 19.70 גרם של שמרים פעילים יבשים, 87.22 גרם של ארוחת תירס ו 7.83 גרם אגר. שלבו את התוכן המפורט לעיל ב- crockpot והפכו את החום ל- 250°F. מערבבים היטב את המרכיבים. יש לשמור את המכסה על התערה בזמן שהמזון המעופף מתחמם תוך כדי ערבוב התוכן כל 10 דקות עד שהוא מגיע לרתיחה מתגלגלת. מניחים לרתיחה המתגלגלת להימשך 20 דקות לפני כיבוי החום. מוסיפים 83.60 מ”ל מים ושמור על מכסה התרגרות כשהמזון מתקרר. מערבבים ומתוקלטים את טמפרטורת המזון כל 10 דקות עם מדחום זכוכית. הימנעו מלתת לשכבת פילם להתיישב על גבי האוכל. לאחר שהמזון התקרר ל-60°C, הוסף 10.44 מ”ל של Tegosept ו-5.51 מ”ל של חומצה פרופיונית לליטר מים (ראה שלב 1.1). מערבבים היטב והופכים את החום ל-60 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהמזון להיות קריר מדי. לשאוב את מזון לטוס לפי הצורך באמצעות מילוי Droso. עבור בקבוקונים צרים, משאבה 10 מ”ל עבור 6 oz בקבוקים תחתית ריבוע משאבה 60 מ”ל. 2. איסוף זבובים בגיל מוגדר צג בקבוקים מסוג בר זבובים מאוחסנים ב 25 ° C במשך 5-7 ימים עד כמויות גדולות של גלם (כ 200 גופה) מחוברים לצד של הבקבוק. הבקבוקים המשמשים הם 6 oz בקבוקי מלאי Drosophila עם תחתית מרובעת. נקה מבוגרים קיימים מהבקבוק. או להטות את המבוגרים לבקבוק חדש או למקם אותם ב-70% אתנול. השתמש בקצה המשעמם של #0 צבע כדי לדחוף את כל המבוגרים הנותרים לתוך האוכל לטוס. הקפד לנגב את מברשת הצבע עם 70% אתנול לפני ואחרי שימושים. אפשרו לבקבוקים נקיים לשבת במשך 3 ימים באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לדור הבא להתקלקל. זבובים אלה יהיו בני 0 עד 3 ימים. 3. הפרדת זבובים לאחר 3 ימים, להפריד זכרים מן הנקבות ולאסוף את המספר הרצוי עבור כל מין עבור כל אחת מארבע נקודות הזמן. זבובים יכולים להיות מבדילים על ידי מין על ידי בדיקת איברי מין; לזכרים יש איברי מין מעוגלים כהים ואילו לנקבות יש איברי מין בהירים ומחודדים יותר. הנקבות גם הרבה יותר גדולות מזבובים זכרים. השתמש כרית הרדמה CO2 כדי להפריד ביעילות את הזבובים ולהבדיל בין המינים. להזיז את הזבובים עם מברשות צבע כדי למנוע להרוג אותם. לאסוף 100 זכרים ו 100 נקבות עבור כל נקודת זמן, עם 50 זכרים לכל בקבוקון ו 100 נקבות לכל בקבוקון. זכרים נוטים להיות אגרסיביים יותר והאינטראקציות החברתיות שלהם להוביל הרבה מקרי מוות כאשר יש 100 אנשים במבעון. הנקבות, עד 100 אנשים, אינן מושפעות בזמן שהן נמצאות במבעון. בצע את האוספים בנקודות הזמן הבאות: ZT1, ZT7, ZT13 ו- ZT19 (טבלה 1). שים לב כי אוספים המנוונים בחושך (ZT12-ZT24) רגישים לאור ואילו אוספי ZT0-ZT11 נעשים בשעות תאורה ואורות החדר עשויים להיות דולקים. אנא שימו לב כי שתי אינקובטורים נפרדים משמשים עם דפוסי אור הפוכים של 12 שעות כדי לאפשר לכל האוספים להתרחש במהלך היום ולא בלילה. השתמשו בזבובים עודפים כדי ליצור בקבוקי זבובים חדשים לאמוניה עתידית. מניחים 25 נקבות עם 5-7 זכרים בכל בקבוק חדש וממקמים באינקובטור ב-25°C. 4. דגירה זבובים לאפשר לזבובים להישאר באינקובטורים מוסדרים אור במשך 3-5 ימים כדי לאפשר את ההמולה היממה להתרחש. ודא כי האינקובטורים הם אור הדוק כי אפילו כמויות קטנות של זיהום אור יפריעו לאמוניה. 5. קיבעון אימונו-השפלה לאחר אימון, להכין בקבוקונים חדשים של פתרון קיבעון עבור דגימות שישמשו עבור immunofluorescence. לפני הסרת הזבובים מהאינקובטור, להוסיף 4.8 מ”ל של 4% פורמלדהיד מדולל 1x PBS + 0.1% Tween-20 לכל בקבוקון צר חדש עבור כל 100 זבובים כי הם להיות מקובע. כל בקבוקון יכן 100 זבובים זכרים או 100 נקבות היממה. מניחים את הבקבוקונים הצרים בקרח. 6. אוסף אימונולוסיות בעת איסוף הזבובים מהאינקובטור לצורך אימונופלואורסצנטי, הסירו את פקק הבקבוק והפכו במהירות את הבקבוק למשפך. תקיש בעדינות את הזבובים לתוך התמיסה דרך המשפך כדי לעזור להנחות את הזבובים לתוך הבקבוקון; לשלב שני צינורות של 50 זכרים עבור סך של 100 זכרים במבחנה אחת ולהשתמש בצינור יחיד של 100 נקבות עבור הבקבוקון השני. בצע אוספי ZT13 ו- ZT19 בחושך; השתמשו באור אדום כדי לראות כמו drosophila הם הרבה פחות רגיש לאורכי גל אור אלה ולכן נוטים פחות זיהום אור13. חלבון קריפטוכרום, בפרט, רגיש במיוחד לאור כחול, אשר יש להימנע14. כדי להפחית את החשיפה לאור, ודא שחדר האיסוף יהיה בהיר עם מקורות אור חסונים או מכוסים. עטו בקבוקונים אלה בנייר כסף כך שזבובי ZT13 ו-ZT19 לא ייחשפו לאור כאשר הם מונחים על מערבל האגוזים בשלב הבא. זבובי ZT1 ו-ZT7 אינם רגישים לאור ותוכלים למצוא ם על המיקסר ללא כיסוי נייר כסף. 7. מערבל ואחסון Nutating לאחר איסוף הזבובים, הדביקו את החלק העליון של הבקבוקונים המכילים קיבעון כדי למנוע שפיכה והניחו אותם על מערבל האגוזים ב-165 סל”ד ב-4°C למשך 4 שעות. הזבובים כבר אינם רגישים לאור לאחר שלב קיבעון זה, כך שנייר הכסף עשוי להיות מוסר כדי לוודא שהפתרון זז וזבובים שקועים במתקן. לאחר הסרת הזבוב המכיל בקבוקונים מערבל אגוז להסיר את הפורמלדהיד ולשטוף שלוש פעמים עם 3,000 μL של 1x PBS, היפוך הבקבוקון עם כל שטיפה. אחסן את הבקבוקונים הנושאים דגימות אימונו-לורה ב-4°C כדי להמתיןל-15 מעלות. 8. איסוף להפקת חלבונים הכן ארבעה צינורות 50 מ”ל וDewar המכיל חנקן נוזלי לשימור דגימות להפקת חלבון לאיסוף זבובים להפקת חלבון או חומצה נוקלית, להעביר זבובים מהבקבוקים לצינור באותו אופן כמו בשלב 6.1 במהירות לכסות את הצינור כדי למנוע את שחרורו של זבובים ולמקם את הצינור לתוך חנקן נוזלי כדי להקפיא הצמד. 9. אחסון להפקת חלבונים לאחסן דגימות קפואות להפקת חלבונים ב-80°C. אלה יכולים להיות מעובדים על פי פרוטוקול הפקת חלבון המתאים לניתוח במורד הזרם, כולל immunoblotting16.

Representative Results

אימונים ביולוגיים מבוקרים מאפשרים לחוקרים לבחון ביולוגיה בנקודות זמן ספציפיות במהלך היום הביולוגי באמצעות לוחות הזמנים של התזמון ZT1-ZT19 או להוסיף נקודות זמן במידת הצורך. כאן אנו משתמשים באור וחושך כדי להעיר זבובים למחזורים היממה ולאמת את ההתעוות על ידי ניתוח אימונופולוטס וחיסונים של החלבון התקופתי, סמן להמולה ביולוגית(איור 1). עם ההתגייסות הנכונה, חלבונים תקופתיים צריכים להיות בעלי עוצמהוניידות אופייניים (איור 1א’)ויש לראותם במקומות ספציפיים במוח ZT1(איור 1ב’). למרות משתנים אחרים, כולל מזון וטמפרטורה, יכולים להשפיע על ההמולה היממה, האור הוא הפשוט ביותר ואמין לשלוט17. לצורך שיטות אלה, טמפרטורות האינקובטור נשמרות קבועות, תוך הסתמכות על תאי עצב של שעון מוחי המושפעים על ידי אור לארופה18. איור 1: אימות של תמלילת. (א)Immunoblotting של תמציות תאים שלמים שהוכנו מראשי זבובים מיומנים מראה דפוסים כנוניים של ניידות חלבון תקופתית ועוצמה19. 1.4 ראשים נשיים מכל אחד מהזמני Zeitgeber המצוינים (ZT) נותחו באמצעות נוגדן נגד פר. (ב)אימונופלואורסצנציה של מוחות מיומנים שנאספו ב ZT, שם חלבון תקופתי נמצא בתבנית אופיינית (לוחות תחתונים, מחדש מן הלפריץ’-פורסטר20). מוצגות תמונות שצולמו מחלקים שונים של המוח, לכידת כל הנוירונים צפוי להכיל חלבון תקופה ב ZT1. סרגל קנה מידה הוא 40 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו. ZT1 (1) ZT7 (119) ZT13 (13) ZT19 (19) אור בין השעות 10:00-22:00 אור בין השעות 10:00-22:00 חושך בין השעות 09:00-21:00 חושך בין השעות 09:00-21:00 נאסף בשעה 11:00 לאחר שעה אחת באור נאסף בשעה 17:00 לאחר 7 שעות באור נאסף בשעה 10:00 לאחר שעה בחושך נאסף בשעה 16:00 לאחר 7 שעות בחושך טבלה 1: ZT1-ZT19 לוחות זמנים לתזמון שעון ביולוגי.

Discussion

החוקרים משתמשים בפרוטוקול תדרם זה עם הצלחה ועקביות. הליך זה מאפשר קיבעון של מאגר דגימה גדול שניתן לאחסן לניתוח עתידי. בנוסף, אסטרטגיה זו משמרת את הדפוסים הנוירולוגיים המושרים על ידי תחומים לבדיקה עתידית.

קיבעון לאחסון הוא מרכיב מרכזי של תהליך ההתעקמה כפי שהוא עוזר לייצב את רקמת המוח וזה מאפשר יותר זמן לנתח כל מוח ממאגר הנתונים ובכך למזער פסולת ממוח שמאבדים את הכדאיותבשל גיל 21. המטרה העיקרית היא להסית כמה שיותר זבובים, כך שיש מלאי רציף זמין עבור דיסטוריראש ובסופו של דבר immunofluorescence או חלבון מיצוי כדי לבחון את הממצאים ולקבוע אם התוצאות הן של ביטחון גבוה. כדי להבטיח כי ההמולה היממה נשמרת באמצעות קיבעון, זה חלק בלתי נפרד כי כל מקור של זיהום אור מחוסל. תהליך קיבעון מאפשר Drosophila להיות מאוחסן תוך שמירה על “מכתם הזמן” הנוירולוגי שלה, כך שהם יכולים להיות לנתח מאוחר יותר וניתח ללא הבדלים מורגש זבובים כי הם נותחו ועברו אימון מאולפת מיד לאחר entraination. למטרות קיבעון לפני אימונו-לודרשות, המעבדה קבעה בעקביות כי זבובים הם קיימא לפחות עד חודש אחד. קיבעון עבור הפקת חלבון כתם המערבי להפוך את המוח קיימא ללא הגבלת זמן כאשר מאוחסנים ב -80 ° C.

צעד קריטי נוסף הוא סקסינג של הזבובים. חשוב כי צעד זה נעשה במדויק כמו שיש שני המינים באותו בקבוקון לפני קיבעון יכול להוביל הזדווגות, אשר יניב זבובים חדשים כי הם בגיל צעיר ניתוח חלבון מושחת אם זכרים נבדקים בטעות במקום נקבות או להיפך. בנוסף, כאשר sexing חשוב להסיר דגימות זחלים כי הם לפעמים מחוברים לנקבות. זה מונע את התפתחותו של צוויה חדשה בתוך הבקבוקון הנשי שעלול להשחית תוצאות.

השלב הבא עבור פרוטוקול ההתעוות עשוי להיות עם פריטים הקשורים לניתוח נתונים. המוקד של הפרוטוקול הוא ליקוטליזציה של חלבון, אבל אם יש משתנים אחרים מושפעים על ידי הכשרה היממה, הם חייבים להיחקר דרך שדרות חדשות, לעתים קרובות הדורשים חלבון או שאיבת חומצה גרעין. בנוסף, ישנם חלבונים אחרים של המוח כי עדיין ניתן לנתח באמצעות פרוטוקול זה. הניסויים הקשורים בפרוטוקול ניתחו חלבונים מסוימים, אך רשימת הגנים והחלבונים המותחים תפקיד בביולוגיה היממה לא מיצתה את מצבם. הפרוטוקול יעיל בהשגת המטרה של הקמת שעון ביולוגי, עם זאת, היישומים הם רחבים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

תודה מיוחדת לאוניברסיטת מיזורי-קנזס סיטי ומעבדת ג’פרי ל. פרייס.

Materials

100-1000uL pipette Eppendorf ES-1000
10-100uL pipette Eppendorf ES-100
16% Paraformaldehyde Solution 15710
1X PBS Caisson Labs PBL01-6X100ML
Agar Fisher Scientific BP1423500
Anesthesia Filter Connection Kit World Precision Instruments EZ-251A
Corn meal Genesee Scientific 62-100
Dried Molasses Food Service Direct OT280504
Droso-filler Food Pump geneseesci.com 59-169
Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs geneseesci.com 32-130BF
Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk geneseesci.com 32-118SB
Dry active yeast Genesee Scientific 62-103
Ethanol IBI Scientific IB15720
EZ Basic Anesthesia System World Precision Instruments EZ-175
Falcon Centrifuge tubes Corning 352097
Falcon round bottom tubes Corning 352057
Fine point Sharpie marker Sharpie 30001
Fisherbrand Nutating Mixer Fisher Scientific 88-861-043
Flugs-Narrow Plastic Vials Genesee Scientific 49-102
Glass Thermometer Cole-Palmer EW-08008-12
Liquid nitrogen hose Thermo Scientific 398202
Liquid nitrogen tank-Dewar Cooper Surgical Inc 900109-1
Liquid nitrogen transfer vessel Electron Mircoscopy Sciences 61891-02
Paintbrushes(Red Sable) Size #0 Electro Microscopy Sciences 66100-00 This is used to separate the flies via sex without causing injury.
Plastic funnel Plews and Edelmann 570-75-062
Polarizing light microscope Microscope Central 1100100402241 Used to more clearly view Drosophila during sexing
ProPette Pipette Tips MTC Bio Incorporated P5200-100U
ProPette Pipette Tips MTC Bio Incorporated P5200-1M
ProPette Pipette Tips MTC Bio Incorporated P5200-5M
Propionic Acid Sigma Aldrich P1386-1L
Rayon Balls Genesee Scientific 51-100
Reynolds wrap standard aluminum foil Staples 1381273
Roaster Oven (Crockpot) Hamilton Beach 32950
Scotch 810 Magic Tape Electron Microscopy Sciences 77300
Spray bottle with trigger US Plastic 66446 Used to spray ethanol to clean work bend areas
Tegosept Genesee Scientific 20-258
Thermo Scientific Drosophila Incubator Thermo Scientific 3990FL
Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge ThermoFisher Scientific REL7504D
Thermo Scientific Revco Lab Freezer ThermoFisher Scientific REL7504A
Tween 20 Anatrace T1003-1-GA

References

  1. Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
  2. Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
  3. Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
  4. Hood, S., Amir, S. Neurodegeneration and the Circadian Clock. Frontiers in aging Neuroscience. 9, 170 (2017).
  5. Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
  6. Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
  7. Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
  8. Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
  9. Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
  10. Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
  11. Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
  12. Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
  13. Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
  14. Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
  15. Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
  16. Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
  17. Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science’s signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
  18. Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
  19. Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
  20. Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
  21. Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).

Play Video

Cite This Article
Dada, A. O., Nguyen, M. Q., Peterson, S. M., Ngo, V. T., Cornelio-Parra, D. V., Omer, B. S., Thapa, A., Rapp, S. R., Cloud, V. J., Mohan, R. D. Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (160), e61176, doi:10.3791/61176 (2020).

View Video