Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC’ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8’ine iki nokta mutasyonu getirildi.
RNA rehberliğinde Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)-Cas9 gibi özel olarak tasarlanmış endonükleazlar, memeli hücrelerinde etkili genom düzenlemesini mümkün kılar. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinde bir örnek olarak hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunu sorunsuz bir şekilde genom düzenlemesi için ayrıntılı prosedürleri açıklıyoruz. Domuzcuk bazlı bir donör plazmidi ve CRISPR-Cas9 nickaz mutantını iki aşamalı bir genetik seçimde birleştirerek, HNF4α lokusunun doğru ve verimli bir şekilde hedeflendiğini gösteriyoruz.
İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC’ler), araştırma veya klinik1 için sınırsız bir somatik hücre kaynağını temsil eder. hPSC’lerde gen hedefleme, hücre spesifikasyonu sırasında gen fonksiyonunu incelemek ve hastalık mekanizmalarını anlamak için güçlü bir yöntem sunar. Etkili genom düzenleme yöntemleri mevcut olmasına rağmen, hPSC’lerdeki genleri modifiye etmek teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. hPSC’lerde homolog rekombinasyon ile standart gen hedeflemesi düşük frekansta gerçekleşir veya bazı genlerde bile tespit edilemez 2 ve DNA çift iplikçik kırılması (DSB) uyarılmış gen hedeflemesi (gen düzenleme olarak adlandırılır) bu nedenle bu hücrelerde gereklidir 2,3. Ek olarak, hPSC’lerin transfeksiyonu ve ardından tek hücreli klonlama, tek hücreyle ilişkili apoptoz, Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü4 kullanılarak azaltılabilse de, çok verimli değildir. Son olarak, ilgilenilen gendeki potansiyel hedef içi ve hedef dışı mutasyonlar da sorunlu olabilir. Bu nedenle, hPSC’lerde özel genetik değişiklikler yapmak için güvenilir bir protokol gereklidir.
RNA rehberliğindeki CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) ve CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) teknolojisi artık gen düzenlemede köklü bir araçtır. Transkribe edilmiş CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive edici bir RNA (tracrRNA), Cas9 proteini ile kompleksleşen ve genin spesifik bölünmesine izin veren tek kılavuzRNA’yı (sgRNA) oluşturur. CRISPR / Cas9 sistemi, sgRNA’nın 20-bp kılavuz dizisini değiştirerek programlanabilir, yani protospacer-bitişik motif (PAM) gereksinimini karşılayan hemen hemen her lokus düzenlenebilir. Bununla birlikte, vahşi tip Cas9, kılavuz dizisi ile bir DNA hedefi arasındaki bazı uyumsuzlukları tolere edebilir ve bu da istenmeyen hedef dışı etkilere neden olabilir. Özgüllüğünü arttırmak için, bir nickaz mutantı (Cas9n) geliştirilmiştir. D10A veya N863A mutasyonu içeren bir Cas9n sadece bir fonksiyonel nükleaz alanına sahiptir ve sonuç olarak DNA’yı sadece bir iplikçikte parçalayabilir. Uygun şekilde yerleştirilmiş ve yönlendirilmiş bir çift Cas9n, DNA DSB’yi etkili bir şekilde indükleyebilir ve hedef dışı etkiler önemli ölçüde azalır6. Verimli Cas9n modifikasyonu sağlamak için, iki Cas9n-sgRNA’nın ideal olarak -4 ila 20 bp ofset ile yerleştirilmesi ve her zaman 5′ çıkıntı6 oluşturması gerektiği gösterilmiştir.
Cas9(n)-sgRNA ile indüklenen DSB, hPSC’lerde genom düzenleme için kullanılabilir 7,8. Homolog olmayan uç birleştirme onarımı yoluyla gen nakavtı oluşturabilir veya bir donör DNA şablonu mevcutsa, homolojiye yönelik onarım (HDR) yoluyla gen modifikasyonu yapabilir. Burada açıklanan protokol, HDR için bir piggyBac transpozon bazlı donör plazmidi (veya hedefleme vektörü) kullanır, burada bir ilaç direnci belirteci transpozon ters çevrilmiş tekrarlarla çevrilidir. Bu yaklaşımın avantajı, ilk olarak Yusa ve ark.9,10 tarafından gösterildiği gibi verimli tarama ve kesintisiz gen düzenlemeyi içerir. İlaç seçim kaseti, hücrelerin entegre vektörle zenginleştirilmesine izin verir, bunlar daha sonra HDR tarafından türetilenleri tanımlamak için bağlantı PCR ile taranır. Ek olarak, ilaç seçim kaseti Cas9 (n) bölünmesi için hedef dizilerin yerini alacak şekilde konumlandırılabilir, böylece HDR’den sonra başka DNA kırılması meydana gelmez, böylece Cas9 (n) yeniden bölünmesinden kaynaklanan ‘açık’ hedef mutasyonları ortadan kaldırır. Ayrıca, piggyBac transpozaz tarafından katalize edilen hassas eksizyondan yararlanarak, seçim belirteci daha sonra bir yara izi bırakmadan genomdan eksize edilir. İlaç seçim belirteci9’un çıkarılmasından sonra sadece piggyBac yerleştirme için orijinal endojen TTAA dizisi kalır. TTAA sitelerinin ikameler getirilerek oluşturulması gerekse bile, rahatsız edici düzenleyici unsurların olasılığı diğer yöntemlere kıyasla azalır10.
Burada, hPSC’lerde kesintisiz genom düzenlemeyi uygulamak için ayrıntılı prosedürleri açıklıyoruz. Domuzcuk bazlı bir donör plazmidini ve CRISPR-Cas9 nickaz mutantını iki aşamalı bir genetik seçilimde birleştirerek, hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) gen11’e önceden belirlenmiş iki nokta mutasyonu getirdik. Bu yaklaşım güvenilir ve verimlidir ve insan pluripotent kök hücrelerinden endoderm ve hepatosit spesifikasyonunda HNF4α’nın oynadığı önemli rollerin derinlemesineanalizine izin vermiştir 11.
Burada açıklanan protokol, önceden belirlenmiş nokta mutasyonlarını hPSC’lerde endojen bir lokusa sokmak için kullanılabilir. Domuzcuk tabanlı bir hedefleme vektörü ve eşleştirilmiş CRISPR / Cas9n ekspresyon plazmidlerinin kombinasyonunun güvenilir ve verimli olduğu kanıtlandı11. HNF4α gen düzenlemesini takiben, analiz edilen 43 klondan 12’si, bağlantı PCR taraması ile belirlenen şekilde doğru bir şekilde hedeflenmiştir. Spesifik olarak, bialelik hedefleme etkinliği yaklaşık% 21 (9/43) ve monoalelik hedefleme verimliliği% 7 (3/43) civarındaydı.
Hedefleme deneylerini takiben, taramanın ilk turu sırasında hedeflenen lokusun piggyBac transpozazı için erişilebilir olmasını sağlamak için puromisin seçimini sürdürmek çok önemlidir. Bu, PGK promotör güdümlü puro-deltaTK seçim kasetinin susturulmasını en aza indirecek vetarama 10’un ikinci turunda arka planı azaltacaktır. Yakın tarihli bir rapor, CAG promotörünün susturulmaya karşı hPSC14’teki PGK promotöründen daha dirençli olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, seçim kaseti için promotörün değiştirilmesi gelecekte bu sistemi geliştirebilir. HiPBaz ve GFP transfekte hücrelerden dirençli kolonilerin sayısını karşılaştırmak da önemlidir. Transpozonun başarılı bir şekilde çıkarılmasından sonra, hipPBazdan GFP-transfekte hücrelerden daha fazla hayatta kalan koloni olmalıdır. Transpozon eksizyonunun PCR analizine ek olarak, eksizyon doğruluğunu doğrulamak için modifiye bölgenin doğrudan sıralanması gerekir.
Yusa’nın piggyBac transpozon tabanlı hedefleme vektörü stratejisi 9,10’a dayanarak, yukarıda ayrıntılı olarak açıklanan prosedürler hPSC’lerin nükleofeksiyonunu ve tek hücre klonlama verimliliğini artırmaya odaklandı. Hücre tohumlama yoğunluğu, heterojen koloni oluşumu olasılığını azaltmak için optimize edilmiştir. Ayrıca, genotip taraması için koloni üretimini arttırmak için% 10 CO2’nin altında 10-12 günlük kültür kullandık. Deneyimlerimize göre, her 96 kuyucuklu plakadan yaklaşık 20 koloni elde edilebilir. Bu adım diğer yöntemlerden daha fazla zaman alabilse de, güvenilir ve oldukça verimlidir.
İhtiyaca bağlı olarak, hedefleme vektörleri, nokta mutasyonlarını tanıtmak veya düzeltmek, muhabir hücre çizgileri oluşturmak ve nakavt gen ekspresyonu oluşturmak için tasarlanabilir. Sonuç olarak, CRISPR / Cas9 (n) sisteminin ve bir hedefleme vektörünün kombinasyonu, farklı türlerde genetiği değiştirilmiş hPSC’ler sunmanın etkili bir yoludur.
The authors have nothing to disclose.
Kosuke Yusa’ya pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK ve pCMV-hyPBase plazmidlerini paylaştığı için teşekkür ederiz. Jia-Yin Yang ve Karamjit Singh-Dolt’a genom düzenleme konusundaki yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz. D.C.H. laboratuvarı, Baş Bilim İnsanı Ofisi (TC/16/37) ve İngiltere Rejeneratif Tıp Platformu (MR/L022974/1) tarafından verilen bir ödülle desteklenmektedir. YW, Çin Burs Konseyi ve Edinburgh Üniversitesi tarafından finanse edilen bir doktora bursu ile desteklendi.
Anti-Human SSEA4 PE | eBioscience | 12-8843-42 | |
Anti-Human TRA-1-60 PE | eBioscience | 11-0159-42 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
DPBS with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
FIAU | Moravek | M251 | |
Gentle cell dissociation reagent | Stem Cell Technologies | 07174 | |
H9 human embryonic stem cells | WiCell | WA09 | |
Human NANOG antibody | R&D systems | AF1997 | |
Human OCT4 antibody | Abcam | AB19857 | |
Human stem cell Nucleofector kit 1 | Lonza | VPH-5012 | |
Mouse IgG3 isotype control PE | eBioscience | 12-4742-41 | |
mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 85850 | |
Nucleofector 2b device | Lonza | AAB-1001 | |
pCMV-hyPBase | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pMCS-AAT_PBPGKpuroTK | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462) | Addgene | PX462 | |
Puromycin dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A11138-03 | |
QIAprep spin maxiprep kit | Qiagen | 12162 | |
QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Recombinant laminin 521 | BioLamina | LN521 | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Y-27632(Dihydrochloride) | Millipore | SCM075 |