원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

1. CRISPR/Cas9n-sgRNA 발현 플라스미드 설계 및 구성 수정할 부위 근처의 5′-NGG의 바로 업스트림에 있는 20bp 가이드 시퀀스를 검색합니다. 스트렙토코커스 화농성의 Cas9 니카제(Cas9n)를 사용할 때는 한 쌍의 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 필요합니다. 한 쌍의 sgRNA는 -4 내지 20 bp 오프셋6으로 니킹 시 5′ 오버행을 생성할 수 있어야 한다. 필요한 올리고와 pSpCas9n-2A-퓨로 벡터를 주문하십시오. 공개된 프로토콜12에 따라 Cas9n과 공동 발현하기 위해 pSpCas9n 벡터 내로 sgRNA를 복제합니다. 2. piggyBac 기반 타겟팅 벡터 설계 및 구성 표적 유전자 서열을 다운로드하고 변형할 부위 근처의 TTAA 부위를 검색한다.참고: TTAA 사이트와 수정할 사이트 사이의 거리는 가능한 한 작아야 합니다. 코딩 서열 내에 있고 TTAA 부위가 100-bp 거리 내에 존재하지 않는 경우, 동의어 뉴클레오티드 치환을 만들어 TTAA 부위를 도입할 필요가 있다. 상동성 암(HA)을 설계하고 HA에 원하는 점 돌연변이를 통합합니다. HA의 최적 길이는 약 500 – 1200 bp 여야합니다.참고: 잠재적인 Cas9n 재절단을 피하기 위해 PAM 서열을 돌연변이시키기 위해 동의어 뉴클레오티드 치환을 도입하는 것이 좋습니다. 확립된 프로토콜10에 따라 최종 표적화 벡터를 구축한다.참고: 여기에 사용된 표적화 벡터에서, PGK 프로모터 구동 puro-deltaTK 선택 카세트는 트랜스포존 반전 반복에 의해 측면에 있다. 3. 인간 만능줄기세포의 유전자 편집 mTeSR1 배지13의 재조합 라미닌 521 코팅 표면 (5 μg / mL)에서 37 ° C 및 5 % CO2의 가습 인큐베이터에서 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC)를 유지합니다. 세포는 1:3 분할 비율 후 72시간 후에 70-85% 컨플루언시에 도달해야 합니다.참고: 존재하는 경우, 매일 배지를 바꾸기 전에 자발적으로 분화된 세포를 부드럽게 흡인하여 제거하십시오. 형질주입 당일에, 24웰 플레이트의 웰을 37°C에서 300μL의 라미닌 521 용액(5μg/mL)으로 최소 2시간 동안 코팅합니다. 코팅 용액을 부드럽게 제거하고 10μM ROCK 억제제가 보충된 신선한 mTeSR1 배지 300μL를 각 웰에 추가한 다음 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 세포를 받습니다.알림: 라미닌 코팅 용액을 제거할 때 플레이트가 건조되지 않도록 하십시오. 인큐베이터에서 스톡 hPSC를 옮기고 사용한 배지를 제거한 다음 멸균 1x DPBS 1mL를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. 1mL의 부드러운 세포 해리 시약을 6웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 37°C에서 6-8분 동안 배양하여 세포를 해리합니다.알림: 플레이트를 부드럽게 두드리고 세포가 쉽게 분리될 수 있는지 확인하여 소화가 충분히 긴지 여부를 결정합니다. P1000 팁을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 모든 hPSC를 들어 올립니다. 10μM ROCK 억제제(Y-27632)가 보충된 신선한 mTeSR1 배지 2mL를 세포 현탁액에 추가하여 해리를 종료합니다. 잘 혼합하고 단일 세포 현탁액을 50mL 튜브로 옮기고 실온에서 3분 동안 200 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 제거하고, 10 μM ROCK 억제제가 보충된 2 mL의 신선한 mTeSR1 배지에 세포를 웰 재현탁시킨다. 혈구계를 사용하여 생존 세포를 계수하십시오. 트리판 블루를 사용하여 죽은 세포를 염색하고 배제합니다. 각 뉴클레오펙션 반응을 위해 8 x 105 대 1 x 106 개의 살아있는 세포를 1.5mL 튜브로 옮기고 200 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오. 인간 줄기 세포 핵 절제 키트의 혼합 핵 펙션 용액 / 보충제 100μL에 쌍을 이루는 Cas9n-sgRNA 발현 플라스미드 3μg과 표적 벡터 플라스미드 5μg을 혼합합니다. 키트로부터의 GFP 대조군 플라스미드를 사용하고 GFP 대조군 플라스미드 믹스도 제조한다.참고: 핵형성 전에 내독소 오염을 줄이기 위해 모든 플라스미드의 맥시 프렙을 만드는 것이 중요합니다. 플라스미드의 농도는 약 1μg/μL이어야 합니다. DNA 믹스(부피 ~111μL)를 사용하여 준비된 세포를 재현탁하고 기포를 피하면서 전기천공 큐벳(뉴클레오펙션 키트와 함께 제공됨)으로 옮깁니다. 핵 장치를 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포에 최적화 된 조건을 선택하여 세포를 전기 천공합니다.참고 : 인간 다 능성 줄기 세포에 핵 펙션 키트를 처음 사용하는 경우 전기 천공 프로그램을 테스트하고 가장 효율적인 프로그램을 선택해야합니다. 전기천공된 세포에 10μM ROCK 억제제가 보충된 37°C mTeSR1 배지에 신선하고 따뜻한 500μL를 즉시 추가합니다. 혼합물을 단계 3.2 및 3.3으로부터 제조된 24-웰 플레이트의 2웰로 옮긴다. 플레이트를 신속하게 37 ° C / 5 % CO2 인큐베이터에 다시 넣고 세포가 회복되도록합니다. 12-16시간 후에 셀 유지 관리 매체를 교체합니다. 세포가 세포-세포 접촉을 확립한 경우, ROCK 억제제를 중단하고, 그렇지 않다면, 억제제로 배지를 계속 보충한다. 24-48시간 사이에 대조군 세포에서 GFP 발현을 검사하여 뉴클레오펙션 효율을 확인합니다. GFP 양성 세포는 30% 이상이어야 합니다. 핵 형성 48시간 후, mTeSR1 배지에 1μg/mL 퓨로마이신을 보충하여 세포 선택을 시작합니다. 핵 채취 후 72시간 후에 mTeSR1 배지에 0.5μg/mL 퓨로마이신을 보충합니다. 세포 컨플루언시가 30% 미만인 경우, 또한 10 μM ROCK 억제제로 배지를 보충한다. 핵체 채취 후 4-6일 후, 퓨로마이신 내성 세포를 0.8 세포/웰의 농도로 10-15 x 96-웰 플레이트에 계대합니다.참고: 10μM ROCK 억제제와 0.5μg/mL 퓨로마이신으로 배지를 보충하는 것이 필수적입니다. 이들 세포를 37°C/10%CO2 에서 10-12일 동안 유지하여 단일 세포 유래 콜로니를 형성한다. 파종 후 7 일 후에 한 번 매체를 채우십시오.알림: 증가 된 CO2 수준은 우리의 경험에서 단일 hPSC가 식민지를 형성하는 데 도움이됩니다. 단일 콜로니가 포함된 웰을 표시하고 배지를 0.5μg/mL 퓨로마이신이 포함되지만 ROCK 억제제가 없는 신선한 mTeSR1 배지로 교체합니다.참고: 이 시점부터 세포는 37°C/5%CO2 하에서 성장합니다. 이틀 후, 미분화 콜로니를 포함하는 웰의 배지를 변경하십시오. 배지에 10μM ROCK 억제제와 0.5μg/mL 퓨로마이신을 보충합니다.참고: 일부 웰에서는 세포가 분화되어 폐기해야 할 수 있습니다. P2 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 부드럽게 긁어냅니다. 하나의 콜로니에서 파생된 세포 현탁액을 별도의 96웰 플레이트에 있는 2개의 새로운 웰로 옮기고 하나는 유전형 분석에 사용하고 다른 하나는 유지에 사용합니다.알림: 콜로니를 조심스럽게 유지하고 자발적인 분화 수준을 최소한으로 유지하는 것이 중요합니다. 대부분의 웰에서 컨플루언스가 50% 이상에 도달하면 유전형 분석을 위해 세포가 들어 있는 플레이트를 꺼냅니다. 사용한 배지를 덤프 한 다음 DPBS로 세포를 한 번 세척하십시오. Bradley 용해 완충액을 사용하여 웰에서 세포를 용해하고 관련 프로토콜(https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate)에 따라 플레이트의 각 웰에서 게놈 DNA를 분리합니다. 3-프라이머 접합 PCR 방법을 사용하여 좌측 및 우측 상동성 모두를 독립적으로 유전자형화한다10.참고: PCR 방법을 보여주는 체계가 그림 2에 나와 있습니다. Sanger 시퀀싱을 위해 4-5개의 콜로니에서 두 상동성 암에 대한 접합 PCR 산물을 보내고 서열을 얻습니다.참고: 2개의 확립된 콜로니의 시퀀싱 결과는 그림 3A에 나와 있습니다. 올바른 유전자형으로 식민지를 유지하고 나머지는 폐기하십시오. 지속적인 puromycin 선택하에 올바른 콜로니를 확장하고 가능한 한 빨리 동결하십시오. 4. 표적 인간 만능 줄기 세포에서 트랜스포존 제거 0.5 μg/mL 퓨로마이신 선택 하에서 올바른 유전자형을 가진 하나의 콜로니를 유지하십시오. 뉴클레오펙트 8 x 10 5 내지 1 x 10 상기 기재된 바와 같이5 μg 과민성 트랜스포아제 (pCMV-hyPBase)를 갖는6 세포 (섹션 3, 단계 3.4-3.18). GFP 대조군 뉴클레오펙션을 병렬로 수행합니다.알림: 퓨로 마이신은 이러한 세포를 핵 형성 한 직후 mTeSR1 배지에서 제거해야합니다. 공개된 절차10에 따라 제거된 puro-deltaTK 선택 카세트로 세포를 성장시키고 스크리닝합니다.참고: 원래 절차를 주의 깊게 따르는 것이 중요합니다. FIAU 또는 1-(2-데옥시-2-플루오로-β-d-아라비노푸라노실)-5-요오도라실)는 단순 포진 바이러스 유래 티미딘 키나아제(HSV-tk)계 음성 선택을 위한 티미딘 유사체로서 사용되었다. 트랜스포존의 제거를 확인하기 위해 변형된 영역을 시퀀싱한다.참고: 3개의 확립된 콜로니의 시퀀싱 결과는 그림 3B에 나와 있습니다. 올바른 유전자형으로 식민지를 유지하고 추가 사용을 위해 확장하십시오. 추가 분석을 위해 사용하기 전에 선택한 콜로니에서 다 능성 마커의 특성화를 수행하십시오.참고: 확립된 두 콜로니의 특성은 그림 4에 나와 있습니다.