Här beskriver vi en detaljerad metod för sömlös genredigering i mänskliga pluripotenta stamceller med hjälp av en piggyBac-baserad donatorplasmid och Cas9 nickase-mutanten. Tvåpunktsmutationer infördes i exon 8 av hepatocytkärnfaktorn 4 alfa (HNF4α) locus i mänskliga embryonala stamceller (hESC).
Specialdesignade endonukleaser, såsom RNA-styrda Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, möjliggör effektiv genomredigering i däggdjursceller. Här beskriver vi detaljerade procedurer för att sömlöst genomredigera hepatocytkärnfaktorn 4 alfa (HNF4α) locus som ett exempel i humana pluripotenta stamceller. Genom att kombinera en piggyBac-baserad donatorplasmid och CRISPR-Cas9-nickasmutanten i ett tvåstegs genetiskt urval visar vi korrekt och effektiv inriktning av HNF4α-locus.
Humana pluripotenta stamceller (hPSC) utgör en obegränsad källa till somatiska celler för forskning eller kliniken1. Geninriktning i hPSC erbjuder en kraftfull metod för att studera genfunktion under cellspecifikation och för att förstå sjukdomsmekanismer. Även om det finns effektiva genomredigeringsmetoder är det fortfarande tekniskt utmanande att modifiera gener i hPSC. Standardgeninriktning genom homolog rekombination i hPSC sker vid låg frekvens eller är till och med omöjlig att upptäcka vid vissa gener 2, och DNA-dubbelsträngsbrott (DSB) stimulerad geninriktning (kallad genredigering) är därför nödvändig i dessa celler 2,3. Dessutom är transfektion av hPSC och efterföljande encellskloning inte särskilt effektiv, även om encellsassocierad apoptos kan minskas genom användning av den Rho-associerade proteinkinashämmaren (ROCK)4. Slutligen kan de potentiella on-target och off-target mutationerna vid genen av intresse också vara problematiska. Därför är ett tillförlitligt protokoll viktigt för att göra skräddarsydda genetiska förändringar i hPSC.
Den RNA-styrda CRISPR-tekniken (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) och CRISPR-associerad protein 9 (Cas9) är nu ett väletablerat verktyg inom genredigering. Transkriberat CRISPR-RNA (crRNA) och ett transaktiverande RNA (tracrRNA) bildar single guide RNA (sgRNA), som komplex med Cas9-protein som möjliggör genspecifik klyvning5. CRISPR/Cas9-systemet är programmerbart genom att ändra en 20-bp-guidesekvens för sgRNA, vilket innebär att nästan alla lokus som uppfyller kravet på protospacer-angränsande motiv (PAM) kan redigeras. Den vilda typen Cas9 kan dock tolerera vissa missmatchningar mellan dess guidesekvens och ett DNA-mål, vilket kan orsaka oönskade effekter utanför målet. För att förbättra dess specificitet har en nickasmutant (Cas9n) utvecklats. En Cas9n som innehåller D10A- eller N863A-mutation har bara en funktionell nukleasdomän och kan som ett resultat bara nicka DNA på en sträng. Ett par Cas9n lämpligt åtskilda och orienterade kan effektivt inducera DNA DSB och off-target-effekterna reduceras dramatiskt6. För att säkerställa effektiv Cas9n-modifiering har det visat sig att två Cas9n-sgRNA helst bör placeras med en förskjutning på -4 till 20 bp och alltid skapa ett 5 ‘överhäng6.
Cas9(n)-sgRNA-inducerad DSB kan användas för genomredigering i hPSCs 7,8. Det kan skapa gen knockout via icke-homolog end joining repair, eller införa genmodifiering genom homologi-riktad reparation (HDR) om en donator-DNA-mall finns. Protokollet som beskrivs här använder en piggyBac transposonbaserad donatorplasmid (eller målvektor) för HDR, där en läkemedelsresistensmarkör flankeras av transposonens inverterade upprepningar. Fördelen med detta tillvägagångssätt inkluderar effektiv screening och sömlös genredigering, vilket först demonstrerades av Yusa et al.9,10. Läkemedelsvalskassetten möjliggör anrikning av celler med den integrerade vektorn, som därefter screenas av korsning PCR för att identifiera de som härrör från HDR. Dessutom kan läkemedelsvalskassetten placeras för att ersätta målsekvenserna för Cas9(n)-klyvning, så att inget ytterligare DNA-brott inträffar efter HDR, vilket eliminerar “på”-målmutationer till följd av Cas9(n)-klyvning. Dessutom, genom att utnyttja den exakta excisionen som katalyseras av piggyBac-transposas, skärs selektionsmarkören sedan ut från genomet utan att lämna ett ärr. Endast den ursprungliga endogena TTAA-sekvensen för piggyBac-insättning kvarstår efter avlägsnandet av läkemedelsvalsmarkören9. Även om TTAA-anläggningarna måste skapas genom att införa substitutioner minskar risken för störande regleringselement jämfört med andra metoder10.
Här beskriver vi detaljerade procedurer för att implementera sömlös genomredigering i hPSC. Genom att kombinera en piggyBac-baserad donatorplasmid och CRISPR-Cas9-nickasmutanten i ett tvåstegs genetiskt urval introducerade vi två förutbestämda punktmutationer i hepatocytkärnfaktorn 4 alfa (HNF4α) gen11. Detta tillvägagångssätt är tillförlitligt och effektivt och har möjliggjort djupgående analyser av de viktiga roller som HNF4α spelar i endoderm- och hepatocytspecifikationen från humana pluripotenta stamceller11.
Protokollet som beskrivs häri kan användas för att införa förutbestämda punktmutationer i en endogen plats i hPSC. Kombinationen av en piggyBac-baserad målvektor och parade CRISPR/Cas9n-uttrycksplasmider visade sig vara tillförlitliga och effektiva11. Efter HNF4α-genredigering riktades 12 av 43 analyserade kloner korrekt som bestämdes av korsnings-PCR-screening. Specifikt var den bialleliska måleffektiviteten cirka 21% (9/43) och den monoalleliska måleffektiviteten var cirka 7% (3/43).
Efter riktade experiment är det viktigt att upprätthålla puromycinselektionen för att hålla det riktade locuset tillgängligt för piggyBac-transposaset under den första screeningomgången. Detta kommer att minimera tystnaden av den PGK-promotordrivna puro-deltaTK-urvalskassetten och minska bakgrunden i den andra omgången av screening10. En ny rapport visade att CAG-promotorn är mer motståndskraftig mot tystnad än PGK-promotorn i hPSCs14. Att byta promotor för urvalskassetten skulle därför kunna förbättra detta system i framtiden. Det är också viktigt att jämföra antalet resistenta kolonier från hyPBas- och GFP-transfekterade celler. Vid framgångsrikt avlägsnande av transposonen bör det finnas fler överlevande kolonier från hyPBas- än GFP-transfekterade celler. Förutom PCR-analys av transposon excision krävs direkt sekvensering av den modifierade regionen för att bekräfta excisionstroheten.
Baserat på Yusas piggyBac transposonbaserade inriktningsvektorstrategi 9,10, fokuserade procedurerna ovan på att förbättra hPSCs nukleofektion och encellskloningseffektivitet. Cellsåddstätheten optimerades för att minska sannolikheten för heterogen kolonibildning. Vi använde också 10-12 dagars kultur under 10% CO2 för att förbättra koloniproduktionen för genotypscreening. Enligt vår erfarenhet kunde cirka 20 kolonier erhållas från varje 96-brunnsplatta. Även om det här steget kan ta mer tid än andra metoder är det pålitligt och mycket effektivt.
Baserat på behovet kan inriktningsvektorer utformas för att införa eller korrigera punktmutationer, för att skapa reportercellinjer samt knockout-genuttryck. Sammanfattningsvis är kombinationen av CRISPR/Cas9(n)-systemet och en målvektor ett effektivt sätt att leverera olika typer av genetiskt modifierade hPSC.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Kosuke Yusa för att ha delat pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK och pCMV-hyPBase plasmider. Vi tackar Jia-Yin Yang och Karamjit Singh-Dolt för hjälpsamma diskussioner om genomredigering. D.C.H.-labbet stöds av en utmärkelse från Chief Scientist Office (TC/16/37) och UK Regenerative Medicine Platform (MR/L022974/1). Y.W. stöddes av ett doktorandstipendium finansierat av Chinese Scholarship Council och University of Edinburgh.
Anti-Human SSEA4 PE | eBioscience | 12-8843-42 | |
Anti-Human TRA-1-60 PE | eBioscience | 11-0159-42 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
DPBS with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
FIAU | Moravek | M251 | |
Gentle cell dissociation reagent | Stem Cell Technologies | 07174 | |
H9 human embryonic stem cells | WiCell | WA09 | |
Human NANOG antibody | R&D systems | AF1997 | |
Human OCT4 antibody | Abcam | AB19857 | |
Human stem cell Nucleofector kit 1 | Lonza | VPH-5012 | |
Mouse IgG3 isotype control PE | eBioscience | 12-4742-41 | |
mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 85850 | |
Nucleofector 2b device | Lonza | AAB-1001 | |
pCMV-hyPBase | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pMCS-AAT_PBPGKpuroTK | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462) | Addgene | PX462 | |
Puromycin dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A11138-03 | |
QIAprep spin maxiprep kit | Qiagen | 12162 | |
QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Recombinant laminin 521 | BioLamina | LN521 | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Y-27632(Dihydrochloride) | Millipore | SCM075 |