Her beskriver vi en detaljeret metode til problemfri genredigering i humane pluripotente stamceller ved hjælp af et piggyBac-baseret donorplasmid og Cas9 nickasemutanten. To punktmutationer blev indført i exon 8 af hepatocytkernefaktor 4 alfa (HNF4α) locus i humane embryonale stamceller (hESC’er).
Specialdesignede endonukleaser, såsom RNA-guidede Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, muliggør effektiv genomredigering i pattedyrceller. Her beskriver vi detaljerede procedurer for problemfri genomredigering af hepatocytkernefaktor 4 alfa (HNF4α) locus som et eksempel i humane pluripotente stamceller. Ved at kombinere et piggyBac-baseret donorplasmid og CRISPR-Cas9 nickasemutanten i en to-trins genetisk selektion demonstrerer vi korrekt og effektiv målretning af HNF4α-locus.
Humane pluripotente stamceller (hPSC’er) repræsenterer en ubegrænset kilde til somatiske celler til forskning eller klinikken1. Genmålretning i hPSC’er tilbyder en kraftfuld metode til at studere genfunktion under cellespecifikation og til at forstå sygdomsmekanismer. Selvom der findes effektive genomredigeringsmetoder, er det stadig teknisk udfordrende at ændre gener i hPSC’er. Standard genmålretning ved homolog rekombination i hPSC’er forekommer ved lav frekvens eller er endda uopdagelig ved nogle gener 2, og DNA dobbeltstrengsbrud (DSB) stimuleret genmålretning (kaldet genredigering) er derfor nødvendig i disse celler 2,3. Derudover er transfektion af hPSC’er og efterfølgende enkeltcellekloning ikke særlig effektiv, selvom enkeltcelleassocieret apoptose kan reduceres ved brug af den Rho-associerede proteinkinase (ROCK) hæmmer4. Endelig kan de potentielle on-target og off-target mutationer ved genet af interesse også være problematiske. Derfor er en pålidelig protokol afgørende for at foretage skræddersyede genetiske ændringer i hPSC’er.
Den RNA-guidede CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) og CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) teknologi er nu et veletableret værktøj inden for genredigering. Transskriberet CRISPR RNA (crRNA) og et transaktiverende RNA (tracrRNA) danner single guide RNA (sgRNA), som komplekser med Cas9-protein, der tillader genspecifik spaltning5. CRISPR/Cas9-systemet er programmerbart ved at ændre en 20-bp guidesekvens af sgRNA’et, hvilket betyder, at næsten ethvert sted, der opfylder kravet om protospacer-tilstødende motiv (PAM), kan redigeres. Vildtypen Cas9 kan dog tolerere nogle uoverensstemmelser mellem dens guidesekvens og et DNA-mål, hvilket kan forårsage uønskede off-target-effekter. For at forbedre dens specificitet er der udviklet en nickasemutant (Cas9n). En Cas9n indeholdende D10A eller N863A mutation besidder kun et funktionelt nukleasedomæne og kan som følge heraf kun hakke DNA på en streng. Et par Cas9n passende fordelt og orienteret kan effektivt inducere DNA DSB, og off-target effekterne reduceres dramatisk6. For at sikre effektiv Cas9n-modifikation har det vist sig, at to Cas9n-sgRNA ideelt set skal placeres med en -4 til 20 bp-forskydning og altid skabe et 5′-udhæng6.
Cas9(n)-sgRNA induceret DSB kan anvendes til genomredigering i hPSC’er 7,8. Det kan skabe gen knockout via ikke-homolog endesammenføjningsreparation eller introducere genmodifikation gennem homologi-rettet reparation (HDR), hvis en donor-DNA-skabelon er til stede. Den her beskrevne protokol anvender et piggyBac-transposonbaseret donorplasmid (eller målretningsvektor) til HDR, hvor en lægemiddelresistensmarkør flankeres af transponens omvendte gentagelser. Fordelen ved denne tilgang inkluderer effektiv screening og problemfri genredigering som først demonstreret af Yusa et al.9,10. Lægemiddeludvælgelseskassetten tillader berigelse af celler med den integrerede vektor, som efterfølgende screenes ved kryds-PCR for at identificere dem, der er afledt af HDR. Derudover kan lægemiddeludvælgelseskassetten placeres til at erstatte målsekvenserne for Cas9 (n) spaltning, så der ikke opstår yderligere DNA-brud efter HDR, hvilket eliminerer ‘on’ målmutationer som følge af Cas9 (n) genspaltning. Ved at udnytte den præcise excision, der katalyseres af piggyBac-transposase, fjernes selektionsmarkøren fra genomet uden at efterlade et ar. Kun den oprindelige endogene TTAA-sekvens for piggyBac-indsættelse forbliver efter fjernelsen af lægemiddeludvælgelsesmarkøren9. Selv om TTAA-lokaliteterne skal oprettes ved at indføre substitutioner, mindskes chancerne for forstyrrende reguleringselementer i forhold til andre metoder10.
Her beskriver vi detaljerede procedurer for implementering af problemfri genomredigering i hPSC’er. Ved at kombinere et piggyBac-baseret donorplasmid og CRISPR-Cas9 nickasemutanten i en to-trins genetisk selektion introducerede vi to forudbestemte punktmutationer i hepatocytkernefaktor 4 alfa (HNF4α) genet11. Denne fremgangsmåde er pålidelig og effektiv og har gjort det muligt at foretage dybtgående analyser af de vigtige roller, som HNF4α spiller i endoderm- og hepatocytspecifikationen fra humane pluripotente stamceller11.
Protokollen beskrevet heri kan bruges til at indføre forudbestemte punktmutationer i et endogent sted i hPSC’er. Kombinationen af en piggyBac-baseret målretningsvektor og parrede CRISPR/Cas9n-ekspressionsplasmider viste sig at være pålidelig og effektiv11. Efter HNF4α-genredigering blev 12 ud af 43 analyserede kloner korrekt målrettet som bestemt ved kryds PCR-screening. Specifikt var den bialleliske målretningseffektivitet ca. 21% (9/43), og den monoalleliske målretningseffektivitet var omkring 7% (3/43).
Efter målretningsforsøg er det afgørende at opretholde puromycinselektion for at holde det målrettede locus tilgængeligt for piggyBac-transposase under den første screeningsrunde. Dette vil minimere lyddæmpningen af den PGK-promotordrevne puro-deltaTK-udvælgelseskassette og reducere baggrunden i anden runde af screening10. En nylig rapport viste, at CAG-promotor er mere modstandsdygtig over for lyddæmpning end PGK-promotor i hPSC’er14. Ændring af promotoren til udvælgelseskassetten kan derfor forbedre dette system i fremtiden. Det er også vigtigt at sammenligne antallet af resistente kolonier fra hyPBase- og GFP-transficerede celler. Efter vellykket fjernelse af transposonen skulle der være flere overlevende kolonier fra hyPBase- end GFP-transficerede celler. Ud over PCR-analyse af transponudskæring kræves direkte sekventering af det modificerede område for at bekræfte excision-troskaben.
Baseret på Yusas piggyBac transposonbaserede målretningsvektorstrategi 9,10 fokuserede de ovenfor beskrevne procedurer på at forbedre hPSC’ernes nukleofektions- og enkeltcellekloningseffektivitet. Cellesåningstætheden blev optimeret for at reducere sandsynligheden for heterogen kolonidannelse. Vi anvendte også 10-12 dages kultur under 10% CO2 for at forbedre koloniproduktionen til genotypescreening. Efter vores erfaring kunne der opnås omkring 20 kolonier fra hver 96-brøndplade. Selvom dette trin kan tage mere tid end andre metoder, er det pålideligt og yderst effektivt.
Baseret på behovet kan målretningsvektorer designes til at introducere eller korrigere punktmutationer, for at skabe reportercellelinjer samt knockout-genekspression. Afslutningsvis vil jeg sige, at kombinationen af CRISPR/Cas9(n)-systemet og en målretningsvektor er en effektiv måde at levere forskellige typer genetisk modificerede hPSC’er på.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Kosuke Yusa for at dele pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK og pCMV-hyPBase plasmider. Vi takker Jia-Yin Yang og Karamjit Singh-Dolt for nyttige diskussioner om genomredigering. D.C.H. lab støttes af en pris fra Chief Scientist Office (TC/16/37) og UK Regenerative Medicine Platform (MR/L022974/1). Y.W. blev støttet af et ph.d.-stipendium finansieret af Chinese Scholarship Council og University of Edinburgh.
Anti-Human SSEA4 PE | eBioscience | 12-8843-42 | |
Anti-Human TRA-1-60 PE | eBioscience | 11-0159-42 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
DPBS with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
FIAU | Moravek | M251 | |
Gentle cell dissociation reagent | Stem Cell Technologies | 07174 | |
H9 human embryonic stem cells | WiCell | WA09 | |
Human NANOG antibody | R&D systems | AF1997 | |
Human OCT4 antibody | Abcam | AB19857 | |
Human stem cell Nucleofector kit 1 | Lonza | VPH-5012 | |
Mouse IgG3 isotype control PE | eBioscience | 12-4742-41 | |
mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 85850 | |
Nucleofector 2b device | Lonza | AAB-1001 | |
pCMV-hyPBase | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pMCS-AAT_PBPGKpuroTK | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462) | Addgene | PX462 | |
Puromycin dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A11138-03 | |
QIAprep spin maxiprep kit | Qiagen | 12162 | |
QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Recombinant laminin 521 | BioLamina | LN521 | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Y-27632(Dihydrochloride) | Millipore | SCM075 |