Her beskriver vi en detaljert metode for sømløs genredigering i humane pluripotente stamceller ved hjelp av et piggyBac-basert donorplasmid og Cas9 nickasemutanten. To punktmutasjoner ble introdusert i ekson 8 av hepatocyttkjernefaktoren 4 alfa (HNF4α) locus i humane embryonale stamceller (hESCs).
Spesialdesignede endonukleaser, for eksempel RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, muliggjør effektiv genomredigering i pattedyrceller. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for sømløst genomredigering av hepatocyttkjernefaktor 4 alfa (HNF4α) lokus som et eksempel i humane pluripotente stamceller. Ved å kombinere et piggyBac-basert donorplasmid og CRISPR-Cas9 nickase-mutanten i et to-trinns genetisk utvalg, demonstrerer vi riktig og effektiv målretting av HNF4α-lokuset.
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) representerer en ubegrenset kilde til somatiske celler for forskning eller klinikken1. Genmålretting i hPSCs tilbyr en kraftig metode for å studere genfunksjon under cellespesifikasjon og for å forstå sykdomsmekanismer. Selv om effektive genomredigeringsmetoder eksisterer, er det fortsatt teknisk utfordrende å modifisere gener i hPSCs. Standard genmålretting ved homolog rekombinasjon i hPSCs forekommer ved lav frekvens eller er til og med uoppdagelig ved noen gener 2, og DNA-dobbeltstrengsbrudd (DSB) stimulert genmålretting (kalt genredigering) er derfor nødvendig i disse cellene 2,3. I tillegg er transfeksjon av hPSCs og påfølgende encellet kloning ikke veldig effektiv, selv om enkeltcelleassosiert apoptose kan reduseres ved bruk av Rho-assosiert proteinkinase (ROCK) inhibitor4. Endelig kan de potensielle on-target og off-target mutasjonene ved genet av interesse også være problematiske. Derfor er en pålitelig protokoll avgjørende for å gjøre skreddersydde genetiske endringer i hPSCs.
Den RNA-guidede CRISPR -teknologien (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) og CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) er nå et veletablert verktøy innen genredigering. Transkribert CRISPR RNA (crRNA) og et transaktiverende RNA (tracrRNA) danner enkeltguiden RNA (sgRNA), som komplekser med Cas9-protein som tillater genspesifikk spaltning5. CRISPR/Cas9-systemet er programmerbart ved å endre en 20-bp guidesekvens av sgRNA, noe som betyr at nesten ethvert lokus som oppfyller kravet til protospacer-tilstøtende motiv (PAM) kan redigeres. Imidlertid kan den ville typen Cas9 tolerere noen uoverensstemmelser mellom guidesekvensen og et DNA-mål, noe som kan forårsake uønskede off-target-effekter. For å forbedre spesifisiteten er det utviklet en nickasemutant (Cas9n). En Cas9n som inneholder D10A- eller N863A-mutasjon har bare ett funksjonelt nukleasedomene, og som et resultat kan det bare hakke DNA på en streng. Et par Cas9n hensiktsmessig fordelt og orientert kan effektivt indusere DNA DSB og off-target effekter er dramatisk redusert6. For å sikre effektiv Cas9n-modifikasjon har det vist seg at to Cas9n-sgRNA ideelt sett bør plasseres med en -4 til 20 bp offset og alltid skape et 5 ‘overheng6.
Cas9(n)-sgRNA-indusert DSB kan benyttes til genomredigering i hPSCs 7,8. Det kan skape gen knockout via ikke-homolog endekoblingsreparasjon, eller introdusere genmodifisering gjennom homologi-rettet reparasjon (HDR) hvis en donor-DNA-mal er tilstede. Protokollen beskrevet her bruker et piggyBac transposonbasert donorplasmid (eller målrettingsvektor) for HDR, der en stoffresistensmarkør er flankert av transposon inverterte repetisjoner. Fordelen med denne tilnærmingen inkluderer effektiv screening og sømløs genredigering som først demonstrert av Yusa et al.9,10. Legemiddelvalgkassetten tillater anrikning av celler med den integrerte vektoren, som deretter screenes ved kryss-PCR for å identifisere de som er avledet av HDR. I tillegg kan stoffvalgkassetten plasseres for å erstatte målsekvensene for Cas9 (n) spaltning, slik at det ikke oppstår ytterligere DNA-brudd etter HDR, og eliminerer dermed “på” målmutasjoner som følge av Cas9 (n) re-cleavage. Videre, ved å utnytte den nøyaktige eksisjonen katalysert av piggyBac-transposase, blir seleksjonsmarkøren deretter skåret ut fra genomet uten å etterlate et arr. Bare den opprinnelige endogene TTAA-sekvensen for piggyBac-innsetting gjenstår etter fjerning av legemiddelvalgmarkøren9. Selv om TTAA-nettstedene må opprettes ved å innføre erstatninger, reduseres sjansene for forstyrrende regulatoriske elementer sammenlignet med andre metoder10.
Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for implementering av sømløs genomredigering i hPSC-er. Ved å kombinere et piggyBac-basert donorplasmid og CRISPR-Cas9 nickase-mutanten i et to-trinns genetisk utvalg, introduserte vi to forhåndsbestemte punktmutasjoner i hepatocyttkjernefaktoren 4 alfa (HNF4α) gen11. Denne tilnærmingen er pålitelig og effektiv, og har tillatt grundige analyser av de viktige rollene som HNF4α spiller i endoderm- og hepatocyttspesifikasjon fra humane pluripotente stamceller11.
Protokollen beskrevet her kan brukes til å introdusere forhåndsbestemte punktmutasjoner i et endogent lokus i hPSCs. Kombinasjonen av en piggyBac-basert målrettingsvektor og parrede CRISPR/Cas9n-ekspresjonsplasmider viste seg å være pålitelige og effektive11. Etter HNF4α-genredigering ble 12 av 43 analyserte kloner riktig målrettet som bestemt ved kryss-PCR-screening. Spesielt var den bialleliske målrettingseffektiviteten omtrent 21% (9/43) og den monoalleliske målrettingseffektiviteten var rundt 7% (3/43).
Etter målrettede eksperimenter er det avgjørende å opprettholde puromycinvalg for å holde det målrettede locus tilgjengelig for piggyBac-transposase under den første screeningrunden. Dette vil minimere kneblingen av den PGK-promotordrevne puro-deltaTK-seleksjonskassetten og redusere bakgrunnen i andre runde av screening10. En fersk rapport viste at CAG-promotor er mer motstandsdyktig mot deaktivering enn PGK-promotor i hPSCs14. Endring av promotoren for utvalgskassetten kan derfor forbedre dette systemet i fremtiden. Det er også viktig å sammenligne antall resistente kolonier fra hyPBase- og GFP-transfiserte celler. Ved vellykket fjerning av transposonen bør det være flere overlevende kolonier fra hyPBase- enn GFP-transfiserte celler. I tillegg til PCR-analyse av transposoneksisjon, er det nødvendig med direkte sekvensering av det modifiserte området for å bekrefte eksisjonsgjengivelsen.
Basert på Yusas piggyBac transposonbaserte målrettingsvektorstrategi 9,10, fokuserte prosedyrene beskrevet ovenfor på å forbedre hPSCs nukleofektion og enkeltcellekloningseffektivitet. Cellefrøtettheten ble optimalisert for å redusere sannsynligheten for heterogen kolonidannelse. Vi benyttet også 10-12 dagers kultur under 10% CO2 for å forbedre koloniproduksjonen for genotype screening. Vår erfaring er at rundt 20 kolonier kunne hentes fra hver 96-brønnsplate. Selv om dette trinnet kan ta mer tid enn andre metoder, er det pålitelig og svært effektivt.
Basert på behovet kan målrettingsvektorer utformes for å introdusere eller korrigere punktmutasjoner, for å lage reportercellelinjer, samt knockout-genuttrykk. Avslutningsvis er kombinasjonen av CRISPR/Cas9(n)-systemet og en målrettingsvektor en effektiv måte å levere ulike typer genmodifiserte hPSC-er på.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Kosuke Yusa for å dele pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK og pCMV-hyPBase plasmider. Vi takker Jia-Yin Yang og Karamjit Singh-Dolt for nyttige diskusjoner om genomredigering. D.C.H. lab støttes av en pris fra Chief Scientist Office (TC/16/37) og UK Regenerative Medicine Platform (MR/L022974/1). YW ble støttet av et doktorgradsstipend finansiert av Chinese Scholarship Council og University of Edinburgh.
Anti-Human SSEA4 PE | eBioscience | 12-8843-42 | |
Anti-Human TRA-1-60 PE | eBioscience | 11-0159-42 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
DPBS with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
FIAU | Moravek | M251 | |
Gentle cell dissociation reagent | Stem Cell Technologies | 07174 | |
H9 human embryonic stem cells | WiCell | WA09 | |
Human NANOG antibody | R&D systems | AF1997 | |
Human OCT4 antibody | Abcam | AB19857 | |
Human stem cell Nucleofector kit 1 | Lonza | VPH-5012 | |
Mouse IgG3 isotype control PE | eBioscience | 12-4742-41 | |
mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 85850 | |
Nucleofector 2b device | Lonza | AAB-1001 | |
pCMV-hyPBase | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pMCS-AAT_PBPGKpuroTK | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462) | Addgene | PX462 | |
Puromycin dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A11138-03 | |
QIAprep spin maxiprep kit | Qiagen | 12162 | |
QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Recombinant laminin 521 | BioLamina | LN521 | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Y-27632(Dihydrochloride) | Millipore | SCM075 |