यहां, हम एक पिग्गीबैक-आधारित दाता प्लास्मिड और कैस 9 निकेस उत्परिवर्ती का उपयोग करके मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं में सहज जीन संपादन के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) में हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा (एचएनएफ 4) लोकस के एक्सॉन 8 में दो बिंदु उत्परिवर्तन पेश किए गए थे।
कस्टम डिज़ाइन किए गए एंडोन्यूक्लिज़, जैसे कि आरएनए-निर्देशित क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर)-सीएएस 9, स्तनधारी कोशिकाओं में कुशल जीनोम संपादन को सक्षम करते हैं। यहां हम मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं में एक उदाहरण के रूप में हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा (एचएनएफ 4) लोकस को मूल रूप से जीनोम संपादित करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। दो-चरणीय आनुवंशिक चयन में एक पिगीबैक-आधारित दाता प्लास्मिड और सीआरआईएसपीआर-कैस 9 निकेस उत्परिवर्ती को मिलाकर, हम एचएनएफ 4 के सही और कुशल लक्ष्यीकरण का प्रदर्शन करते हैं।
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) अनुसंधान या क्लिनिक1 के लिए दैहिक कोशिकाओं के असीमित स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। एचपीएससी में जीन लक्ष्यीकरण सेल विनिर्देश के दौरान जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने और रोग के तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली विधि प्रदान करता है। यद्यपि कुशल जीनोम संपादन विधियां मौजूद हैं, एचपीएससी में जीन को संशोधित करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। एचपीएससी में समरूप पुनर्संयोजन द्वारा मानक जीन लक्ष्यीकरण कम आवृत्ति पर होता है या कुछजीनों पर भी पता लगाने योग्य नहीं होता है, और डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) उत्तेजित जीन लक्ष्यीकरण (जिसे जीन संपादन कहा जाता है) इसलिए इन कोशिकाओं में आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, एचपीएससी का अभिकर्मक और बाद में एकल-कोशिका क्लोनिंग बहुत कुशल नहीं है, भले ही एकल सेल से जुड़े एपोप्टोसिस को आरएचओ-संबद्ध प्रोटीन काइनेज (रॉक) अवरोधक4 के उपयोग के माध्यम से कम किया जा सकता है। अंत में, रुचि के जीन पर संभावित ऑन-टारगेट और ऑफ-टारगेट म्यूटेशन भी समस्याग्रस्त हो सकते हैं। इसलिए, एचपीएससी में अनुरूप आनुवंशिक परिवर्तन करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल आवश्यक है।
आरएनए-निर्देशित सीआरआईएसपीआर (क्लस्टर्ड रेगुलरी इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट) और सीआरआईएसपीआर से जुड़े प्रोटीन 9 (सीएएस 9) तकनीक अब जीन संपादन में एक अच्छी तरह से स्थापित उपकरण है। ट्रांसक्रिप्टेड सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरआरएनए) और एक ट्रांस-एक्टिविंग आरएनए (ट्रैकआरएनए) एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) बनाते हैं, जो कैस 9 प्रोटीन के साथ मिलकर जीन विशिष्ट दरार5 की अनुमति देता है। CRISPR / Cas9 प्रणाली प्रोग्राम करने योग्य है, एसजीआरएनए के 20-बीपी गाइड अनुक्रम को बदलकर, जिसका अर्थ है कि प्रोटोस्पेसर-आसन्न आकृति (पीएएम) आवश्यकता को पूरा करने वाले लगभग किसी भी स्थान को संपादित किया जा सकता है। हालांकि, जंगली प्रकार कैस 9 अपने गाइड अनुक्रम और डीएनए लक्ष्य के बीच कुछ बेमेल को सहन कर सकता है, जो अवांछित ऑफ-टारगेट प्रभाव पैदा कर सकता है। इसकी विशिष्टता में सुधार करने के लिए, एक निकेस उत्परिवर्ती (Cas9n) विकसित किया गया है। डी 10 ए या एन 863 ए उत्परिवर्तन युक्त कैस 9 एन में केवल एक कार्यात्मक न्यूक्लियस डोमेन होता है और परिणामस्वरूप केवल एक स्ट्रैंड पर डीएनए निकल सकता है। कैस 9 एन की एक जोड़ी उचित रूप से अंतरिक्ष और उन्मुख डीएनए डीएसबी को प्रभावी ढंग से प्रेरित कर सकती है और ऑफ-टारगेट प्रभाव नाटकीय रूप से कम होजाते हैं। कुशल कैस 9 एन संशोधन सुनिश्चित करने के लिए, यह दिखाया गया है कि दो कैस 9 एन-एसजीआरएनए को आदर्श रूप से -4 से 20 बीपी ऑफसेट के साथ रखा जाना चाहिए और हमेशा 5 ‘ओवरहैंग6 बनाना चाहिए।
Cas9(n)-sgRNA प्रेरित DSB का उपयोग hPSCs 7,8 में जीनोम संपादन के लिए किया जा सकता है। यह गैर-समरूप अंत जुड़ने की मरम्मत के माध्यम से जीन नॉकआउट बना सकता है, या यदि दाता डीएनए टेम्पलेट मौजूद है तो होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के माध्यम से जीन संशोधन पेश कर सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल एचडीआर के लिए एक पिगीबैक ट्रांसपोसन-आधारित दाता प्लास्मिड (या लक्ष्यीकरण वेक्टर) का उपयोग करता है, जिसमें एक दवा प्रतिरोध मार्कर ट्रांसपोसन उल्टे दोहराव से घिरा होता है। इस दृष्टिकोण के लाभ में कुशल स्क्रीनिंग और सहज जीन संपादन शामिल है जैसा कि सबसे पहले युसा एट अल.9,10 द्वारा प्रदर्शित किया गया था। दवा चयन कैसेट एकीकृत वेक्टर के साथ कोशिकाओं के संवर्धन की अनुमति देता है, जिसे बाद में एचडीआर द्वारा प्राप्त लोगों की पहचान करने के लिए जंक्शन पीसीआर द्वारा जांच की जाती है। इसके अलावा, दवा चयन कैसेट को कैस 9 (एन) दरार के लिए लक्ष्य अनुक्रमों को बदलने के लिए तैनात किया जा सकता है, इसलिए एचडीआर के बाद कोई और डीएनए टूटना नहीं होता है, इस प्रकार कैस 9 (एन) पुन: दरार के परिणामस्वरूप ‘ऑन’ लक्ष्य उत्परिवर्तन समाप्त हो जाता है। इसके अलावा, पिगीबैक ट्रांसपोसेस द्वारा उत्प्रेरित सटीक छांटने का फायदा उठाकर, चयन मार्कर को तब निशान छोड़े बिना जीनोम से निकाला जाता है। दवा चयन मार्कर 9 को हटाने के बाद पिगीबैक सम्मिलन के लिए केवल मूल अंतर्जातटीटीएए अनुक्रम रहता है। यहां तक कि अगर टीटीएए साइटों को प्रतिस्थापन पेश करके बनाया जाना है, तो अन्य तरीकों की तुलना में नियामक तत्वों को परेशान करने की संभावना कम होजाती है।
यहां हम एचपीएससी में निर्बाध जीनोम संपादन को लागू करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। दो-चरणीय आनुवंशिक चयन में एक पिगीबैक-आधारित दाता प्लास्मिड और सीआरआईएसपीआर-कैस 9 निकेस उत्परिवर्ती को मिलाकर, हमने हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा (एचएनएफ 4) जीन11 में दो पूर्वनिर्धारित बिंदु उत्परिवर्तन पेश किए। यह दृष्टिकोण विश्वसनीय और कुशल है, और मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से एंडोडर्म और हेपेटोसाइट विनिर्देश में एचएनएफ 4 द्वारा निभाई गई महत्वपूर्ण भूमिकाओं के गहन विश्लेषणकी अनुमति दी है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग एचपीएससी में एक अंतर्जात स्थान में पूर्व निर्धारित बिंदु उत्परिवर्तन पेश करने के लिए किया जा सकता है। एक पिगीबैक-आधारित लक्ष्यीकरण वेक्टर और युग्मित सीआरआईएसपीआर / कैस 9 एन अभिव्यक्ति प्लास्मिडका संयोजन विश्वसनीय और कुशल साबित हुआ। एचएनएफ 4 जीन संपादन के बाद, 43 विश्लेषण क्लोनों में से 12 को जंक्शन पीसीआर स्क्रीनिंग द्वारा निर्धारित सही ढंग से लक्षित किया गया था। विशेष रूप से, बाइएलील लक्ष्यीकरण दक्षता लगभग 21% (9/43) थी और मोनोएलील लक्ष्यीकरण दक्षता लगभग 7% (3/43) थी।
लक्ष्यीकरण प्रयोगों के बाद, स्क्रीनिंग के पहले दौर के दौरान पिग्गीबैक ट्रांसपोसेस के लिए लक्षित स्थान को सुलभ रखने के लिए प्यूरोमाइसिन चयन को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। यह पीजीके प्रमोटर-संचालित प्यूरो-डेल्टाटीके चयन कैसेट को चुप कराने को कम करेगा और स्क्रीनिंग10 के दूसरे दौर में पृष्ठभूमि को कम करेगा। हाल ही में एक रिपोर्ट से पता चला है कि कैग प्रमोटर एचपीएससी14 में पीजीके प्रमोटर की तुलना में चुप कराने के लिए अधिक प्रतिरोधी है। चयन कैसेट के लिए प्रमोटर को बदलने से भविष्य में इस प्रणाली में सुधार हो सकता है। एचआईपीबेस- और जीएफपी-ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं से प्रतिरोधी कॉलोनियों की संख्या की तुलना करना भी महत्वपूर्ण है। ट्रांसपोसन को सफलतापूर्वक हटाने पर, जीएफपी-ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं की तुलना में एचआईपीबेस से अधिक जीवित कॉलोनियां होनी चाहिए। ट्रांसपोसन एक्सिशन के पीसीआर विश्लेषण के अलावा, एक्सिशन फिडेलिटी की पुष्टि करने के लिए संशोधित क्षेत्र के प्रत्यक्ष अनुक्रमण की आवश्यकता होती है।
युसा की पिग्गीबैक ट्रांसपोसन-आधारित लक्ष्यीकरण वेक्टर रणनीति 9,10 के आधार पर, ऊपर दी गई प्रक्रियाओं ने एचपीएससी न्यूक्लियोफेक्शन और एकल सेल क्लोनिंग दक्षता में सुधार पर ध्यान केंद्रित किया। विषम कॉलोनी गठन की संभावना को कम करने के लिए सेल सीडिंग घनत्व को अनुकूलित किया गया था। हमने जीनोटाइप स्क्रीनिंग के लिए कॉलोनी उत्पादन बढ़ाने के लिए 10% सीओ2 के तहत 10-12 दिनों की संस्कृति को भी नियोजित किया। हमारे अनुभव में, प्रत्येक 96-वेल प्लेट से लगभग 20 कॉलोनियां प्राप्त की जा सकती हैं। यद्यपि इस कदम में अन्य तरीकों की तुलना में अधिक समय लग सकता है, यह विश्वसनीय और अत्यधिक कुशल है।
आवश्यकता के आधार पर, लक्ष्यीकरण वैक्टर को रिपोर्टर सेल लाइनों, साथ ही नॉकआउट जीन अभिव्यक्ति बनाने के लिए बिंदु उत्परिवर्तन को पेश करने या सही करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। निष्कर्ष में, CRISPR / Cas9 (n) प्रणाली और एक लक्ष्यीकरण वेक्टर का संयोजन विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक रूप से संशोधित hPSCs को वितरित करने का एक कुशल तरीका है।
The authors have nothing to disclose.
हम पीएमसीएस-AAT_PB-पीजीकेपुरोटीके और पीएमवी-एचवाईपीबेस प्लास्मिड साझा करने के लिए कोसुके युसा को धन्यवाद देते हैं। हम जीनोम एडिटिंग पर उपयोगी चर्चा के लिए जिया-यिन यांग और करमजीत सिंह-डोल्ट को धन्यवाद देते हैं। डीसीएच प्रयोगशाला मुख्य वैज्ञानिक कार्यालय (टीसी / 16/37) और यूके पुनर्योजी चिकित्सा मंच (एमआर / एल 022974/1) से एक पुरस्कार द्वारा समर्थित है। वाईडब्ल्यू को चीनी छात्रवृत्ति परिषद और एडिनबर्ग विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था।
Anti-Human SSEA4 PE | eBioscience | 12-8843-42 | |
Anti-Human TRA-1-60 PE | eBioscience | 11-0159-42 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
DPBS with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
FIAU | Moravek | M251 | |
Gentle cell dissociation reagent | Stem Cell Technologies | 07174 | |
H9 human embryonic stem cells | WiCell | WA09 | |
Human NANOG antibody | R&D systems | AF1997 | |
Human OCT4 antibody | Abcam | AB19857 | |
Human stem cell Nucleofector kit 1 | Lonza | VPH-5012 | |
Mouse IgG3 isotype control PE | eBioscience | 12-4742-41 | |
mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 85850 | |
Nucleofector 2b device | Lonza | AAB-1001 | |
pCMV-hyPBase | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pMCS-AAT_PBPGKpuroTK | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462) | Addgene | PX462 | |
Puromycin dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A11138-03 | |
QIAprep spin maxiprep kit | Qiagen | 12162 | |
QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Recombinant laminin 521 | BioLamina | LN521 | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Y-27632(Dihydrochloride) | Millipore | SCM075 |