효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석
Summary
여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.
Abstract
프로테오박테리아의 지단백질은 3개의 통합 막 효소의 작용에 의해 막 인지질에서 파생된 지방산에 의해 번역 후 변형되어 트리아실화 단백질을 생성합니다. 지단백질 변형 경로의 첫 번째 단계는 포스파티딜글리세롤에서 프롤리포단백질로 디아실글리세릴기를 전달하여 디아실글리세릴 프롤리포단백질을 생성하는 것입니다. 두 번째 단계에서, 프롤리포 단백질의 신호 펩티드는 절단되어 아포지 단백질을 형성하고, 이는 차례로 인지질로부터 유래 된 제 3 지방산에 의해 변형된다. 이 마지막 단계는 아포지 단백질 N- 아실 트랜스퍼 라제 (Lnt)에 의해 촉매됩니다. 지단백질 변형 경로는 대부분의 γ-프로테오박테리아에서 필수적이므로 새로운 항균제 개발을 위한 잠재적인 표적이 됩니다. 여기에 설명된 것은 작은 억제 분자의 고처리량 스크리닝과 호환되는 Lnt에 대한 민감한 분석입니다. 효소와 기질은 막에 매립된 분자입니다. 따라서 체외 테스트의 개발은 간단하지 않습니다. 여기에는 세제의 존재 하에서 활성 효소의 정제, 알킨-인지질 및 디아실글리세릴 펩티드 기질의 가용성, 혼합 미셀에서의 반응 조건이 포함됩니다. 또한, 고처리량 스크리닝(HTS) 설정에서 활성 테스트를 사용하려면 결합 효소 반응보다 반응 생성물의 직접 판독이 선호됩니다. 이 형광 효소 분석에서 알킨-트리아실화 펩타이드 생성물은 클릭-화학 반응을 통해 형광으로 렌더링되고 멀티웰 플레이트 형식으로 검출됩니다. 이 방법은 인지질 및 아실 -CoA를 포함한 지방산 함유 기질을 사용하는 다른 아실 트랜스퍼 라제에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
박테리아 지단백질은 아미노 말단에서 공유 결합 지방산이 특징이며,이를 통해 막 1,2에 고정됩니다. 단백질의 성숙한 부분은 구조와 기능이 매우 다양하여 박테리아 세포 외피의 다양한 생물학적 과정에서 지단백질의 역할을 설명합니다.
지단백질은 세포질 막에 삽입 된 후 인지질 유래 지방산에 의해 변형됩니다. 프로리포단백질은 시그니처 모티프인 리포박스(lipobox)를 함유하고 있으며, 리포박스는 아실화되는 불변 시스테인 잔기와 성숙 단백질의 첫 번째 아미노산을 포함합니다. 이 경로의 첫 번째 단계는 프로리포단백질 포스파티딜글리세롤::d이아실글리세릴 트랜스퍼라제(Lgt)에 의해 촉매되며, 이는 디아실글리세릴과 시스테인 사이의 티오에테르 연결을 통해 포스파티딜글리세롤에서 프롤리포단백질로 디아실글리세릴 그룹을 전달합니다. 신호 펩티다아제 II(Lsp)는 디아실글리세릴 프로리포단백질로부터 신호 펩티드를 절단하여, 디아실글리세릴 부분을 통해 막에 고정된 아포지단타인을 생성한다. 세 번째이자 마지막 단계는 인지질의 sn-1 위치에서 지방산을 아포지단백질에 추가하여 삼아실화된 성숙한 지단백질을 생성하는 아포지단백 N-아실트랜스퍼라제(Lnt)에 의해 촉매됩니다(그림 1)3. Lnt 반응은 안정한 티오에스테르 아실 효소 중간체가 형성되는 2단계 탁구 반응입니다. 리소포지질 부산물은 반응의 제2 단계에서 아포지단백질 기질의 아실화 전에 방출된다.
인지질 기질 특이성은 높은 비율의 트리스-트리신 우레아 SDS-PAGE4에 대한 N-아실 디아실글리세릴 펩티드의 이동성 이동에 기초한 Lnt 분석에서 결정된다. 포화 [sn-1] 및 불포화 [sn-2]의 작은 극성 헤드 그룹을 갖는 인지질이 바람직한 기질4이었다. 겔 이동 분석은 아포지 단백질 N- 아실 트랜스퍼 라제의 광범위한 동역학 연구 나 HTS가 억제 분자를 식별하는 데 적합하지 않습니다. 알킨 지방산을 사용한 클릭 화학은 박테리아5 의 지단백질 변형과 진핵 생물6의 지방산 대사를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 최근에, 라스 팔미토일화의 시험관내 분석이 억제제7을 확인하기 위해 보고되었다.
여기에 설명된 방법에서, 세제 중 정제된 활성 Lnt는 혼합 미셀 내의 기질과 함께 인큐베이션되어 알킨-트리아실화된 펩티드를 형성하고, 이 펩타이드는 후속적으로 형광 분광법에 의해 검출된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 Lnt 분석을 위한 프로토콜은 트리아실화된 생성물의 형광 검출을 기반으로 민감하고 재현 가능합니다. 비오틴과 스트렙타비딘의 특이적이고 효율적인 결합은 분석의 핵심 요소입니다. Lnt 반응 완료 후 남은 알킨-POPE 기질은 또한 FAM으로 형광 표지되지만 여러 세척 단계에 의해 스트렙타비딘 플레이트 상에 결합한 후 효율적으로 제거된다. 또한, DMSO의 첨가는 Lnt 활성에 영향을 미치?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
파리시 파스퇴르 연구소의 기술 자원 및 연구 센터(C2RT)의 화학유전체 및 생물학적 스크리닝 플랫폼의 Fabrice Agou와 Alix Boucharlat에게 프로토콜에 대한 유용한 제안, 지원 및 과학적 토론을 위한 BGPB 부서의 모든 구성원, 원고를 비판적으로 읽어준 Simon Legood에게 감사드립니다. 작업은 Carnot 전염병 연구소와 Carnot 미생물 및 건강 연구소의 Global Care Initiatives (15 CARN 0017-01 및 16 CARN 0023-01)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
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