在这里,我们提出了一个详细的协议,研究神经元+-合成素积累在原发性小鼠多巴胺神经元。神经元中的磷酸化β-合成素聚合体通过预制的β-合成素纤维诱导。免疫荧光标记细胞的自动成像和无偏图像分析使这个强大的协议适用于抑制β-合成素积累的药物的中高通量筛选。
该协议的目标是建立一个健壮和可重复的模型的β-合成素积累在原发性多巴胺神经元。结合免疫污染和无偏自动图像分析,该模型允许分析药物和基因操作对神经元培养文化中的β-合成素聚集的影响。原发性中脑培养提供了真正的胚胎多巴胺神经元的可靠来源。在该协议中,帕金森病的标志组织病理学,Lewy身体(LB),通过添加α-合成素预形成纤维(PFF)直接到神经元培养基。多巴胺神经元的索马内源性磷酸化β-合成素的积累在PFF添加后7天内通过免疫污染检测。体外细胞培养条件也适合应用和评估防止β-核素积累的治疗方法,如小分子药物和神经营养因子,以及用于遗传操作的扁病毒载体(例如,使用CRISPR/Cas9)。在96个井板中培养神经元可提高实验装置的鲁棒性和功率。实验结束时,用对蛋白甲醛固定,用于免疫细胞化学和荧光显微镜成像。多光谱荧光图像是通过96个孔板的自动显微镜获得的。这些数据是量化的(例如,计算每井含有磷-+-合成素的多巴胺神经元的数量)使用自由软件,为无偏见的高含量表型分析提供了一个平台。PFF诱导的磷酸化β-合成素在原发性多巴胺神经元中积累建模,为研究抗合成素内含物的相互作用和消除的基本机制提供了可靠的工具,并有机会进行高通量药物筛选和细胞表型分析。
帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病,其特征是基斯坦丁格拉(SN)中中脑多巴胺神经元的死亡,随后基底神经中多巴胺音的丧失,以及随后的运动损伤,1,2。PD患者大脑中的主要组织病理学特征是细胞内蛋白质/脂质聚集物,它们存在于神经元母体(LB)或中性粒细胞(LN)中,统称为Lewy病理学3。大脑中的 Lewy 病理学似乎随着 PD 的进步而进展, 类似于通过神经元连接传播致病因子。丰富的Lewy病理学发现在SN的多巴胺神经元和受神经退化4影响的其他区域的细胞。然而,在疾病进展期间,蛋白质聚集的传播和发病并不总是与神经元死亡相关,Lewy病理学对神经元死亡的确切贡献仍不清楚5。
LB和LN已被证明由甲壳体和蛋白质成分3组成。前者是膜碎片,车辆结构(可能是裂索体和自噬体)和线粒体3。后者由至少300种不同的蛋白质组成6。斯皮兰蒂尼等人7的一项标志性研究表明,Lewy病理学的主要蛋白质成分是β-合成素。高度表达在神经元中,并链接到膜融合和神经递质释放,在Lewy病理学中,+-合成素大多以错误折叠的淀粉样纤维形式存在,其中的大部分是磷酸化在Ser129(pS129-μsyn)4,8。4,8
重要的是,它也证明,由于其普里昂样的属性,错误折叠的α-合成素可能有一个因果关系在Lewy病理学形成4。错误折叠的β-合成素的prion样特性与患者的中脑提取物和外源性准备的β-合成素预制纤维(PFF)一起显示,以诱导培养和体内神经元,中的β–双核素聚合体。PFF提供了一个可靠和强大的模型来研究多巴胺神经元中α-四核素病理学的进展。当PFF应用于培养的原发神经元或注射到动物大脑时,它们会导致在中性细胞和细胞酶11中形成含有β-合成素的内含物,这些内含物可以重述在Lewy病理学中看到的许多特征。观察到的内含物在Triton X中不溶,泛泛素,沾染淀粉样色特异性染料硫奥夫拉芬S,并含有Α-合成素高磷化在Ser12911,,12。重要的是,这些内含物不会形成于β-合成素敲除动物11中,这表明它们的形成依赖于内源性β-合成素。
然而,很难直接比较PFF诱导的内含物和Lewy病理学发现在PD患者,因为人类LB和LNs是高度异质的3。Lewy 病理学的观察到的异质性可能是由形成的不同阶段、不同的解剖位置或启动聚合过程的错误折叠的 α-合成素的构象差异引起的。同样的因素可能会影响PFF诱导的pS129-μsyn阳性内含物。事实上,最近已经证明,PFF诱导的pS129-μsyn阳性内含物在原发神经元培养中代表病理学的早期阶段,在长时间的潜伏期12、13,之后,这些阶段可以成熟到与LB相似的结构。
使用 PFF 模拟错误折叠的 α-合成素的早期传播和积累对于药物开发很有价值,因为 Lewy 病理传播被认为是早期疾病标志之一。因此,聚合预防性治疗可能有望在早期阶段停止或减缓PD的进展。几个临床试验旨在减缓或停止+-合成素积累正在进行14。对于后期患者来说,移植多巴胺神经元祖细胞可以是一种更好的治疗选择15。然而,在PD患者大脑16、17的验尸分析中,17在移植的胚胎神经元中记录了Lewy病理学,也表明需要防止β-合成素的积累。
在体外,α-突触素PFF已知诱导聚合在不朽的细胞系,或更常见的,在啮齿动物初级海马或皮质神经元。这两个都不是接近重述多巴胺神经元10。培养这些神经元需要密集电镀一定数量的神经元在体外18。为了用有限的材料(如原发性多巴胺神经元)实现高电镀密度,通常采用微岛培养方法。在微岛培养中,细胞最初被镀在一小滴中(通常是几微升),通过表面张力在18号大井中间保持。神经元连接后,整个井充满介质,而细胞仍然限制在高密度的小电镀区。除了实现高电镀密度外,微岛还防止在井边缘附近电镀,因为水井密度和存活率的变化是频繁的。微型岛屿通常用在相对较大的井或盘子中;然而,在微细胞中建立96井板格式的中脑神经元培养,使得在具有中高通量能力的真实多巴胺神经元中研究Lewy病理学。在这些神经元的体外实验使我们能够发现胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF),它促进成熟的多巴胺神经元在体外和,体内19,20,21,22,20的生存21,也防止在多巴胺神经元23中形成β-合成素聚合体。人类患者诱导的多能干细胞衍生多巴胺神经元构成一个更准确的模型,由于其人类起源和更长的体外生存时间。然而,在人类神经元中诱导β-三核素病理学在几个月之后,与小鼠胚胎神经元的一周和/或具有多个压力源(例如,α-合成素过度表达和PFF的组合)相比,24,,25。此外,与初级胚胎神经元相比,人类多巴胺神经元的维持成本更高、更费力,这基本上限制了它们在高通量应用中的使用。
此外,原发性多巴胺神经元培养物可以进行基因改造(例如,使用CRISPR/Cas9)和/或使用药理剂23进行治疗。它们构成了一个快速和可重复的平台,用于分子通路解剖和药物库筛选等应用。即使可以从这些培养物中获得有限的材料,仍然可以进行小尺寸基因组学/蛋白质组学分析。培养96井格式的原发神经元更适合免疫细胞化学和荧光显微镜技术,其次是高含量表型分析。从96个井板的自动成像中得出的多光谱荧光图像可以转换为定量结果(例如,每个孔包含LB神经元的数量)。这样的分析可以通过自由软件,如细胞产品26,27。,27总体而言,在96个井板中镀的原发性胚胎中脑培养提供了一个强大而高效的平台,用于研究多巴胺神经元和β-核素聚集,并有机会进行高通量表型筛查。
传播 Lewy 病理学, 其中 pS129 -μsyn 是主要成分, 是 PD 的一个组织病理学标志。 停止或减缓聚合 pS129-μsyn 的积累可能会减缓多巴胺神经元的退化和α-细胞核素病变的进展。然而,对于pS129-μsyn聚合如何导致多巴胺神经元的消亡,仍必须建立机械学的理解。人类验尸研究来自疾病不同阶段患者的大脑样本的证据,以及观察pS129-μsyn在移植胎儿神经元中的阳性内,强烈表明Lewy病理学在细胞16、17、33,17之间传播。因此,pS129-μsyn的pion样传播最近被使用α-合成素PFF 9,,10 重新概括。建立一个稳健的,经济有效的,相对较高的,或中等的pS129-μsyn传播和积累模型,特别是在多巴胺神经元,可以大大加快寻找新的治疗和化合物的搜索,改变这个过程。
由于多巴胺神经元的丧失是PD中运动症状的主要原因,这些细胞,具有许多独特的特性2、34、35,,34从转化的角度来看,多巴胺神经元pS129-μsyn的pS129-μsyn的普里昂样传播的建模是最相关的模型类型。35在4个井板和半自动定量上利用胚胎中脑神经元的微岛培养的协议已经描述了前18条。此处描述的协议适用于 96 个井板,对微岛进行较少的制备,允许经验丰富的研究人员在一个工作日内制备多达四个包含 60 口井的板块。在96个井板中培养多巴胺神经元,可以以较低的量测试药物,并且能够使用扁病毒载体实现高转导率。也可以结合不同的治疗方法来进行更复杂的实验。
在应用任何治疗(包括PFF)之前,应用亮场显微镜检查培养质量。如果显微镜系统没有利用带暖气的 CO2 室,则不应将细胞保存在培养箱外超过几分钟,因为原发性小鼠多巴胺神经元很细腻,很容易受到压力。出于同样的原因,建议在24小时孵育后(在DIV1-DIV3之间)进行第一次成像。细胞应该看起来与现在的细胞体和同质地分布在微岛内。原发神经元会定居在PO涂层的地面上,并开始建立神经元投影。如果三聚工艺处理不当或电镀密度高于建议,可以观察到小团块(即直径小于 150–200 μm)。这些小团块不会影响实验,除非它们超过几个井和/或更大。在图像分析过程中,块块细胞很难识别免疫组织化学标记物和单个细胞。通过仔细的涂层、三角化和控制电镀密度来避免此类团块至关重要。如果在某些油井中无法观察到这些条件的均匀性,则实验中不要包括这些有缺陷的油井。这种排除应在执行任何治疗之前进行。
此外,96 孔板的利用允许在染色过程中方便多通道移液器使用,并使用自动板显微镜直接可视化,从而进一步提高了吞吐量。利用自动图像量化对于高含量成像平台的数据分析是必不可少的。除了能够处理从每个实验中获得的数千张图像外,它还确保所有治疗组得到无偏、相同的定量。为图像分析提出的工作流程基于简单的原则,即分段多巴胺神经元,通过监督机器学习过滤正确分割细胞,随后通过监督机器学习对表型进行定量(pS129-μsyn阳性和pS129-μsyn阴性)。虽然可以设想几种不同的方法,但我们发现,由于高电镀密度、多巴胺神经元形状不同以及强染色的中性粒细胞的存在,分割与机器学习的结合对多巴胺培养最可靠。提出了图像分析算法,在 CellProfiler 和 CellProfiler 分析师中实现了开源、免费提供的高内容图像分析软件26、27。,27该算法也可以与其他图像分析软件(如图像J/FIJI、KNIME)或专有软件一起实现。但是,根据我们的经验,这些通常会牺牲自定义功能以方便使用,因此在复杂的分析中可能无法很好地执行。我们发现,CellProfiler 和 CellProfiler Analyst 软件包结合了大量已实现的算法、在设计工作流方面极其灵活,同时处理和高效处理高内容成像数据,因此结果特别可靠。
所述协议还可以用于定量其他细胞表型,其特征是免疫具有不同抗体,如其他神经元种群(如DAT、GAD67、5-HT等)的标记物和蛋白质聚合体(如磷蛋白、泛素)。多个荧光标记也可以组合,以区分多个表型(例如,在成熟的不同阶段的内含细胞)。在描述的图像分析管道中,只需将包含其他标记的免疫荧光图像的通道添加到测量步骤中,然后将细胞分拣到多个条柱中,也很容易实现多个表型的自动分类。然而,同时使用多个标记需要优化免疫污染和成像条件。此外,为了提高免疫荧光成像的质量,建议使用专为荧光显微镜设计的专用黑壁96孔板。但是,这些电池培养板的成本可能比标准细胞培养板要贵得多,这足以用于我们协议中描述的分析。
利用的PFF的类型和质量对实验结果至关重要。PFF 可以影响测定的稳健性和结果的解释。制备条件可能会影响PFF的播种效率,事实上,PFF”应变”具有不同的生理特性已经报告36。尽管如此,PFF的编制和验证超出了,本文的范围,并在11、28、29、30,28,29号出版物中都有说明。除了制备协议外,还应考虑PFF中α-合成素的原产地(如小鼠、人类)和野生蛋白质或突变蛋白(如人类 A53T β-合成素)的使用,具体取决于特定的实验条件。PFF对pS129-μsyn积累的诱导证明取决于培养者的年龄(即体外天),更成熟的培养物表现出更明显的诱导11。这可能是由于更成熟培养物中神经元连接数量的增加,以及β-合成素蛋白水平的增加。在我们手中,在DIV8的PFF治疗给出了最有力的结果,在多巴胺神经元索马中pS129-μsyn的显著积累,同时不影响神经元生存。所述协议非常适合研究治疗改变早期事件导致内源性+ 合成素聚集,因为我们量化 pS129-μsyn 阳性内含物在相对早期的时间点,接种后 7 天与 PFF。此时点,体内内内内含物存在于相当一部分细胞中,在未观察到 PFF 诱导细胞死亡时,可以通过免疫抑制轻松区分,从而简化了对结果的解释。重要的是,由于PFF诱导内含物的形态和组成会随着时间12、13的变化而变化,所述协议原则上可以修改,以便以后通过固定和免疫污染来研究更成熟的内含物。然而,在培养物中保持多巴胺神经元超过15天需要极度小心,并且由于细胞无法从PFF接种中独立生存而引起额外的变异。此外,更多的扩展文化使药物治疗计划复杂化。许多化合物在细胞培养基中具有有限或不差的稳定性,而补充药物并非易事,因为完全交换药物会损害多巴胺培养物的生存。
在基于PFF的α-合成素聚合模型中,一致报告了α-合成素聚集的α-合成素的磷酸化,并用错折叠和聚合标记(如硫黄素S、泛素或符合性特异性抗体11、12,12)进行同化。在我们的手中,pS129-μsyn 的免疫保持也提供了最强信号,背景最低,分析最直接,在筛选多种治疗时提供可靠的结果。重要的是,使用pS129-μsyn抗体进行免疫抑制不会检测留在细胞外的PFF,显著减少背景。然而,重要的是要记住,Ser129磷酸化可能是最早与α-合成素的误折叠相关的过程之一,在特定条件下可能有不同的调控。因此,任何显示对pS129-μsyn有积极影响的发现都应得到其他标记的确认。
统计分析应根据实验设计进行相应的调整。在至少三个独立的生物复制(即独立的原神经元培养物)中进行实验至关重要。这些复制应镀在不同的板上,并独立处理。我们分析从随机块设计 ANOVA37 不同板的复制中获得的数据,以考虑不同实验板的数据配对。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Kelvin Luk教授慷慨赠送的α-合成素PFF,郑康琼为建立和培养神经元细胞,以及赫尔辛基大学生物技术研究所的光显微镜组,用于成像免疫污染细胞。这项工作得到了芬兰商业机构(芬兰创新资助机构)、芬兰科学院、#309489、#293392#319195;西格丽德·朱塞柳斯基金会,以及波兰PAS马吉药理学研究所的法定基金。
0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
rabbit monoclonal anti-phospha-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |