Drosophila alkol duyarlılığını ölçmek için geçerli yöntemler sinek grupları test etmek için tasarlanmıştır. Çok sayıda tek sinekte alkol sedasyon hassasiyetini değerlendirmek için basit, düşük maliyetli, yüksek iş çıkışlı bir çalışma salıyoruz. Yöntem özel araçlar gerektirmez ve ortak malzemeler kullanılarak herhangi bir laboratuvarda yapılabilir.
Drosophila melanogaster alkol duyarlılığı genetik temelleri incelemek için mükemmel bir model sağlar. İnsan popülasyonlarında yapılan çalışmaların aksine, Drosophila modeli genetik arka plan üzerinde sıkı kontrol sağlar, ve aynı genotip bireylerin neredeyse sınırsız sayıda düzenleyici kısıtlamalar olmadan ve nispeten düşük maliyetle iyi kontrollü çevre koşulları altında hızla yetiştirilebilir. Etanol maruz sinekler postural kontrol kaybı da dahil olmak üzere, insan alkol zehirlenmesi benzer fizyolojik ve davranışsal değişiklikler e-posta, sedasyon, ve tolerans gelişimi uğrar. Burada, tek sinekçok sayıda alkol sedasyon duyarlılığı değerlendirmek için basit, düşük maliyetli, yüksek ölçekli bir çalışma sonucu tanımlıyoruz. Test, alkole maruz kalmanın senkron başlatılmasını sağlayan bir kurulumda 24 kuyulu hücre kültür plakalarında anestezi olmadan tanıtılan tek sineklerin video kaydına dayanıyor. Sistem tek bir kişi kadar 2.000 sinekler 8 saat çalışma süresi içinde bireysel etanol sedasyon verileri toplamak için olanak sağlar. Tetki, prensipte, herhangi bir uçucu maddeye maruz kalmanın etkilerini değerlendirmek için genişletilebilir ve diğer sinek türleri de dahil olmak üzere diğer böcekler üzerinde uçucu ların akut toksisite etkilerini ölçmek için uygulanır.
Ulusal Alkol Bağımlılığı ve Alkolizm Enstitüsü, 2015 yılında “alkol kullanım bozukluğu” olarak tanımlanan aşırı alkol tüketiminin ABD’de yaklaşık 16 milyon kişiyi etkilediğini bildirmektedir. Alkol kullanımı olumsuz fizyolojik etkileri geniş bir yelpazede neden olur ve ABD’de ölüm önemli bir nedenidir. İnsanlarda, azalmış duyarlılık, ya da alkole yanıt düşük düzeyde, güçlü bir genetik bileşeni vardır ve alkol kullanım bozuklukları geliştirme riski ile ilişkilidir1,2,3,4. İnsan popülasyonları üzerinde yapılan genetik risk çalışmaları, popülasyon karışımı, çeşitli gelişimsel geçmişler ve çevresel maruziyetler ve alkole bağlı fenomentipleri ölçmek için kendi kendine rapor edilen anketlere güvenmek nedeniyle zordur, ki bunlar genellikle diğer nöropsikiyatrik koşullarla birlikte ortaya çıkar.
Drosophila melanogaster alkol duyarlılığıgenetiktemelleri çalışmak için mükemmel bir model sağlar 5,6,7,8. Drosophila modeli genetik arka plan üzerinde sıkı kontrol sağlar, ve aynı genotip bireylerin hemen hemen sınırsız sayıda düzenleyici kısıtlamalar olmadan ve nispeten düşük maliyetle iyi kontrollü çevre koşulları altında hızla yetiştirilebilir. Genomdaki genlerin çoğunluğunu hedef alan halka açık mutasyonlara ve RNAi hatlarına ek olarak, tam genom dizilimi olan 205 inbred yabani kaynaklı çizgilerden oluşan Drosophila melanogaster Genetik Referans Paneli’nin (DGRP) kullanılabilirliği, genom çapında ilişki çalışmaları9,10’usağlamıştır. Bu tür çalışmalar etanol,11,12gelişimsel maruziyet üzerine geliştirme süresi ve canlılık üzerindeki etkileri ile ilişkili genetik ağlar tespit etmiş. Temel biyolojik süreçlerin evrimsel olarak korunması, insan ortolojilerinin uçtaki benzerlerine üst üste bindirilerek çevirisel çıkarımların çizilmesini sağlar.
Etanol maruz sinekler postural kontrolkaybı dadahil olmak üzere insan alkol zehirlenmesi benzer fizyolojik ve davranışdeğişiklikleri geçmesi 8 , sedasyon, ve tolerans gelişimi13,14,15. Drosophila alkol kaynaklı sedasyon inebriometers kullanılarak ölçülebilir. Bu sinekler,16,17,18ekleyebilirsiniz eğimli örgü bölümleri ile 122 cm uzunluğunda dikey cam sütunlar vardır. En az 50 sinekten oluşan bir grup (cinsiyetler ayrı ayrı analiz edilebilir) sütunun üst kısmında tanıtıldı ve etanol buharına maruz kaldı. Postural kontrolü kaybeden sinekler sütundan düşer ve 1 dk aralıklarla toplanır. Ortalama elüsyon süresi alkol zehirlenmesine karşı duyarlılığın bir ölçüsü olarak hizmet vermektedir. Sinekler ilk maruz iyelik ten sonra ikinci kez alkole maruz kaldığında, ortalama elüsyon süresi13,15,,19,20bir kayma belirgin olarak, tolerans gelişebilir. Inebriometer tahliller genlerin belirlenmesine yol açmıştır, genetik ağlar, ve alkol sedasyon duyarlılığı ve tolerans gelişimi ile ilişkili hücresel yollar12,13,14,21, tahlil zaman alıcı, düşük-iş ilişkisi, ve tek sineklerde alkol duyarlılığını ölçmek için etkisiz.
Alternatif etanol sedasyon tahlilleri ayrıntılı inebriometer kurulum gerektirmeyen daha uygun ölçümler için izin ama yine de iş ortalığı sınırlıdır ve genellikle bireyler yerine sinek gruplarının analizleri gerektirir21,22,23,24,25. Tek sineklerin değerlendirilmesi, sosyal davranışlardan kaynaklananlar gibi grup etkileşimleri nedeniyle kafa karıştırıcı etkiler potansiyelini en aza indirir. Burada, tek sinekçok sayıda alkol sedasyon duyarlılığı değerlendirmek için basit, düşük maliyetli, yüksek ölçekli bir çalışma teşp.
Burada, Drosophila melanogasteretanol maruziyeti nedeniyle sedasyon süresini değerlendirmek için basit, ucuz ve yüksek iş verme yöntemi salıyoruz. Grup analizleri gerektiren birçok mevcut yöntemin aksine, bu analiz tek bir kişinin 8 saat çalışma süresi içinde ~2.000 sinek için bireysel sedasyon süresi verilerini toplamasını sağlar. Biz tek bir kişi yaklaşık 5 dakika içinde sedasyon süresi için 48 sinek puan bulundu. Bu hızla, 2.000 sinek yaklaşık 4 saat içinde puanlanabilir, ancak puanlama daha sonra yapılabilir. Bizim tsur, çoğu sinek için kaydedilen sedasyon süresi 5-15 dakika arasında bir pozlama 1 mL 100 etanol arasında değişmektedir. Etanol veya daha küçük teslimat hacimlerinin daha düşük konsantrasyonları daha uzun sedasyon süreleri neden olacaktır.
Sedasyon süresini değerlendirmek için geçerli yöntemler, tek bireyler üzerinde ölçümleri kolayca etkinleştirmeden çok sayıda sinek test gerektirir15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Birçok akım sedasyon ve duyarlılık tahlilleri ST5022,23,,24, sineklerin% 50 etanol maruziyeti sonucu yatıştırıcı olduğu zaman noktası güveniyor. Sinek grupları için ST50’yi elde etmek bu testi geliştirmek için birincil motivasyon olmasa da, video kayıtları mevcut yöntemlere göre daha yüksek bir yarar göstermekte, çünkü kayıtlar, ayrı ayrı test edilmiş sinek grupları için ST50’yi tespit etmek ve belirli bir ölçüte (örn. postural kontrol kaybı) herhangi bir zaman noktasında gelen sineklerin yüzdesini ölçmek için kullanılabilir. Bu tür video analizleri ek zaman gerektireceği unutulmamalıdır.
Mevcut inebriometer tahlillerinden farklı olarak, tanımladığımız yöntem, kurulum için özel araçlar gerektirmez ve ortak malzemeler kullanılarak herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi kullanarak, bireysel sinekler için güvenilir ve tutarlı sedasyon süreleri elde ettik. Tetki, prensipte, herhangi bir uçucu maddeye maruz kalma etkilerini değerlendirmek için uzatılabilir. Tetki, diğer sinek türleri de dahil olmak üzere diğer böcekler üzerinde uçucu akut toksisite etkilerini ölçmek için de uygulanabilir. Bireysel sedasyon süresi verileri, DGRP gibi bir popülasyoniçindeki phenotipik varyasyonun kapsamını değerlendirmek için kullanılabilir.
Biz etanol çözeltisi ile doğrudan temas önlemek için küçük böcek ekran örgü kullanılırken etanol buharı yeterli miktarda sinek ulaşmak için izin verir. Ekran örgü üstünde beyaz peynir bezi tabakası sinek ve aşağıdaki yüzey arasında görsel kontrast sağlar ve sinek ler postural kontrol kaybı belirsiz belirlenmesine yol açabilir ekran örgü, yakalanmış alamadım sağlar. Su ve hava gözenekli ticari olarak kullanılabilir membranlar tutarsız sonuçlar verdi ve yetersiz etanol buharları için transetrable edildi. Biz kasıtlı olarak küçük böcek ekran örgü kullanılan bir kuyu içinde sinek konumu sonucu etanol maruz kalma varyasyonunu en aza indiren bir düzgün gözenekli malzemedir çünkü. Kontrollü bir davranış odası, sineğe yakın %90-%100 etanol erişimi ve tek tip etanol maruziyeti önersek de, mevcut malzemelere dayalı olarak bu protokolde değişiklikler yapılabilir.
Hücre kültür plakaları içinde Sinek konumu konumsal önyargı önlemek için çoğaltmalar arasında randomize edilmelidir. Bu tahkikatın birden çok gün içinde kullanılmasını gerektiren ve bu nedenle taht sonuçlarını etkileyebilecek çevresel farklılıklara tabi olan daha büyük deneyler için (örneğin, barometrik basınçtaki değişiklikler)27, özellikle farklı çizgiler ve/veya cinsiyetler birbirleriyle karşılaştırıldığında, sineklerin her gün aynı anda test edilmesini ve hem gün içinde hem de gün içinde rastgele yapılmasını şiddetle tavsiye ederiz.
Geliştirdiğimiz yöntem en iyi akut alkole maruz kalma nın etkisini ölçmek için uygundur, ancak tüketim verileri elde etmek veya bağımlılık modellemek için uygun değildir. Bu tözden elde edilen alkol sedasyon duyarlılık verileri, ancak, alkole bağlı fenotiplerin diğer önlemler ile entegre edilebilir. Sistemin bir sınırlama standart hücre kültürü plakaları dikey yüksekliği kolayca genel aktivite veya hareket ayrıntılı değerlendirme için video ile takip edilemez dikey sinek hareketi için izin verir. Ancak, bu sınırlama sedasyon süresinin doğru değerlendirilmesini etkilemez. Farklı genotiplerden sinekler kullanırken (örneğin, DGRP kaynaklı dış kaynaklı popülasyonlarda28),bu tetkik aynı zamanda toplu DNA sıralaması ve aşırı QTL haritalama29,30için zıt fenotipler ile sinek havuzları toplamak için bireysel sineklerin alınmasını sağlar. Genel olarak, bu titreşme tek sinekler çok sayıda alkol sedasyon verilerinin hızlı, ucuz toplama izin verir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden TFCM ve RRHA’ya da041613 ve GM128974 hibeleri ile desteklenmiştir.
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |