Bu demir redoks speksiyon yöntemi kapiller elektroforez-endüktif plazma kütle spektrometresi ile birleştirilmiş plazma kütle spektrometresi ve numune istifleme ile tek bir vadede kısa analiz ile birlikte dayanmaktadır. Bu yöntem, çeşitli doku lar ve biyosıvı örnekleri arasında demir redoks türleri için hızlı bir şekilde analiz eder ve düşük niceleme limitleri sağlar.
Demir metabolizmasının dishomestazisi, kanser ve çeşitli nörodejeneratif durumlar da dahil olmak üzere birçok hastalığın patofizyolojik çerçevesi içinde muhasebelenmiştir. Aşırı demir serbest redoks-aktif Fe (II) ile sonuçlanır ve hücre içinde oksidatif stres (OS) ve ferroptosis (FPT) olarak bilinen lipid peroksidasyonu ile ölüm gibi yıkıcı etkilere neden olabilir. Bu nedenle, toplam Fe tayini yerine demir (Fe(II)) ve ferrik (Fe(III)) demirin nicel ölçümleri bu zararlı süreçlere daha yakın bir bakış açısı nın anahtarıdır. Fe(II)/(III) tayinleri, beyin omurilik sıvısı (BOS) gibi ilgili numunelerde hızlı redoks-durum değişimleri ve düşük konsantrasyonlarla engellenebileceğinden, hızlı analiz yapan ve düşük niceleme (LOQ) limitler sağlayan yöntemler kullanılmalıdır. Kapiller elektroforez (CE) hızlı Fe(II)/Fe(III) ayrımı avantajı sağlar ve sabit bir faz olmadan çalışır, hangi redoks dengesi ile müdahale veya analit yapışmasına neden olabilir. CE, dedektör olarak endüktif birleştirilmiş plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) ile birleşerek algılama hassasiyeti ve seçiciliğinin daha da geliştirilmesini sağlar. Sunulan yöntemde arka plan elektroliti olarak 20 mM HCl ve +25 kV voltaj kullan.) Pik şekiller ve konsantrasyon algılama limitleri iletkenlik-pH-istifleme ile geliştirilmiştir. 56[ArO]+, ICP-MS azaltılması için bir reaksiyon gazı olarak NH3 ile dinamik reaksiyon hücresi (DRC) modunda çalıştırıldı. Yöntem, 3 μg/L algılama (LOD) sınırına ulaşır. Pik alana bağlı kalibrasyonlar 150 g/L’ye kadar doğrusal dı. Ölçüm hassasiyeti %2,2 (Fe(III)) ile %3,5 (Fe(II)) idi. Göç süresi hassasiyeti her iki tür için de %1:2 oranında insan nöroblastomu (SH-SY5Y) hücrelerinin seyreltilmiş lysates’inde saptandı. Standart ilave ile kurtarma deneyleri % 97 Fe(III) ve % 105 Fe(II) doğruluğunu ortaya koymuştur. BOS gibi gerçek yaşamdaki biyo-örneklerde, göç süresi değişen iletkenliğe (yani tuzluluğa) göre değişebilir. Böylece, pik tanımlama standart ekleme ile doğrulanır.
Bugün, en çok demir aracılı oksidatif stres (OS) nörodejeneratif beyin bozuklukları özellikle birden fazla bozukluklar önemli bir rol oynadığı açıktır, Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi yanı sıra kanser1,2,3,4. İşletim sistemi, redoks-çift Fe(II)/Fe(III) durumu ve dengesi ile yakından ilişkilidir. Fe(III) redoks-inaktif iken, Fe(II) güçlü reaktif oksijen türleri üretir (ROS) katalize ederek H2O2 ayrışma hidroksil radikal üretim ve membran lipid peroksidasyonu takip5,6. Moleküler düzeyde, Fe(II)-oluşturulan ROS ve peroksidize fosfolipidler proteinlerin bütünlüğü için güçlü bir saldırı vardır, lipidler ve DNA7,8. Bu tür zararlı hücresel disfonksiyon azalmış ATP-içerik 9 ile mitokondriyal disfonksiyon neden gösterilmiştirve hatta programlanmış nekrotik hücre ölümü tetikleyebilir, ferroptoz istiğdrisi olarak bilinen (FPT)10,11. Bu nedenle, kantitatif Fe(II)/(III) redoks sintrasyonu, redoks ile ilişkili bozuklukların geniş bir spektrumda büyük önem taşımaktadır.
Kimyasal türleşme genel olarak iz elementlerbiyolojik rol ve metabolizma çalışması için iyi kurulmuş bir araçtır7,8 yanı sıra nörodejeneratif koşullarda12,13,14,15,16,17. Literatürde bulunan Fe-redoks türezi yöntemleri tipik olarak sıvı kromatografisi (LC) ayrımına dayanır. Literatürde bazı bir element seçici dedektör olarak endüktif birleştirilmiş plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) kullanılır. Ancak, rutin LC çalışmalarında, aşırı tasfiye süreleri çalışır arasında gerekli idi. LC sütunlarının toplu-toplu varyasyonu, her sütun değişikliğinden sonra elüsyon koşullarının yeniden optimizasyonuna zorlanmış olur. Bu sorunlar yüksek iş bilgililiği engelliyor. Kabul edilebilir güvenilirlik kazanmak ve yöntemi yeniden iyice değerlendirmek için ek süre gereklidir.
Bu sakıncaları atlatmak için burada Fe(II)/Fe(III) redoks speksinasyonu için kapiller elektroforez indüktif olarak birleştirilmiş plazma kütle spektrometresi (CE-ICP-MS) üzerine bir yöntem sunulmuştur. CE, LC18’egöre çeşitli avantajlar sunar. Kılcal damarlar sabit faza sahiptir ve bu nedenle toplu kimliğe bağlı değildir (neredeyse) bağlıdır. Yaşlandığında veya engellendiğinde, genellikle değişmeyen performans göstererek hızlı bir şekilde değiştirilirler. Numuneler arasındaki temizleme ve temizleme adımları etkili ve kısadır ve numune başına analiz süresi de kısadır.
Sunulan yöntem liyakat iyi rakamlar ile güvenilirdir. Bir kanıt-of-ilke olarak, yöntem insan dopaminerjik nöroblastom uygulanır (SH-SY5Y) hücre lisat, nörodejenerasyon önemli bir örnek türü yanı sıra kanser araştırma19.
Demir OS ilerlemesinde önemli bir rol oynadığından, mitokondriyal disfonksiyonu veya FTP’yi kolaylaştırdığından, eşzamanlı Fe(II)/Fe(III) türasyonu için çok yönlü bir CE-ICP-MS bazlı kantitatif yöntem bu makalede sunulmuş ve uygulanması hücre lysates’inde örnek olarak gösterilmiştir. Kısa analiz süresi sağlanan yöntem ve liyakat rakamları (LOQ, hassas, kurtarma) özellikle nörodejeneratif ve kanser araştırmalarında demir redoks sinifi ile ilgili örnekler için uygundur. LC’ye dayalı önceki yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu CE tabanlı yöntem sütun toplu işlerinden ve LC sütun değişikliğinden sonra daha önce gözlenen tekrarlanabilirlik sorunlarından pratikte bağımsızdır. Her çalıştırmadan önce kılcal damar hazırlığı <4 dakika ve numune başına analiz süresi 3 dk'ya kadar orta tuzluluktadır. Molekül yükü ve boyutu dışında, CZE'deki geçiş süresi numune fişinde iletkenliğe bağlıdır ve bu da numunelerin kendileri iletkenliği önemli ölçüde etkilediğinde göç zamanı değişimine veya kaymalara neden olur. Geçiş zamanındaki bu tür değişimler kapiller elektroforezde iyi bilinmektedir. Bu bir CZE-immanent sorun, literatür21bilinen,22. Standartlar ve SH-SY5Y hücre lisatları orta ve homojen iletkenliğe sahipti. Sonuç olarak, geçiş zamanları iyi bir hassasiyetle sadece küçük değişiklikler gösterdi. Ancak iletkenliği yüksek olan numunelerde 5 dakikaya kadar uzun süreli göç süreleri görülebilir. Bu nedenle, standart eklemeler net tür tanımlama için tavsiye edilir.
Demir redoks türasyonunda kritik bir konu tür stabilitesidir (yani, Fe(II)/(III) equilibria’nın bakımı) numune hazırlama sırasında8,13. Uygun olmayan pH veya şelatlı kimyasalların yanı sıra numuneyle temas eden oksijen (hava) veya derin dondurulmuş depolamada bir mola gibi uygun olmayan depolama koşulları Fe(II)/(III) dengesini kolayca değiştirebilir. Bu nedenle, SH-SY5Y hücre lisatlarının hazırlanması için, herhangi bir şelat kimyasalı olmadan bir lysis tamponu seçilmiş, fizyolojik pH, ancak numune hazırlama sırasında inert gaz bindirme, numune kaplarında ve bu numuneler için hemen derin donma uygulanmıştır.
Literatürde Fe(II)’yi izlemek için yarı nicel yaklaşımlar bulunabilir. Demirin oksidatif stresteki rolünün daha iyi anlaşılması için, çeşitli araştırma grupları, demirin in vitro anormal yükselmesini yarı nicel olarak izlemek ve görselleştirmek için Fe(II)’ye özgü problar geliştirdiler. Ancak, önemli not, bu tür problar Fe(III) dikkate almayın ve ölçmek değil, sadece “daha fazla” veya “daha az” Fe(II)) rapor. Bugüne kadar, sadece birkaç biyobelirteçleri işletim sistemi ve FPT belirlemek için kullanılabilir, aynı anda Fe(II)/Fe(III) redoks türleri23,,24ölçmek için güvenilir yöntemlerin eksikliği nedeniyle . Bunu göz önünde bulundurarak, sunulan yöntem – her ikisinin de hızlı bir şekilde ölçülmesini kolaylaştırmak, Fe(III) ve Fe(II) tek bir koşuda – demire bağımlı moleküler süreçlere bakış açısını derinleştirmek için umut verici bir araç haline gelebilir.
The authors have nothing to disclose.
VV, Göttingen Üniversitesi Tıp Merkezi’nin intramural araştırma bursu (Forschungsförderung) ve Else Kröner-Fresenius-Stiftung’un Else Kröner araştırma programı tarafından desteklendi.
CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
FeCl3 | Merck | 803945 | |
Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |