Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer
Summary
Burada in vivo B-1a hücre göçve lokalizasyonu incelemek için retroviral aşırı ekspresyon ve murine B-1a hücrelerinin benimsenen transferi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, donör B-1a hücre lokalizasyonunun niceliği veya donör hücre kaynaklı salgılanan faktörlerin benimsenme sonrası salgılanan faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli downstream fonksiyonel tahliller için uzatılabilir.
Abstract
Hücre fonksiyonu hücresel mikroortamda niş özgü faktörlerden etkilendiği gibi, hücre lokalizasyonu ve göç incelemek için yöntemler hücre fonksiyonu hakkında daha fazla fikir sağlayabilir. B-1a hücreleri, sağlık ve hastalık sırasında ortaya çıkan oksidasyona özgü epitoplara karşı koruyucu doğal IgM antikorları üreten farelerde benzersiz bir B hücre alt kümesidir. B-1a hücre igM üretimi B-1a hücre konumuna bağlı olarak değişir, ve bu nedenle yüksek antikor üretimini destekleyen nişler b-1a lokalizasyonu hedef terapötik bir açıdan yararlı olur. Burada C-X-C motifi kemokin reseptör4 (CXCR4) retroviral aracılı aşırı ekspresyonu ile kemik iliği B-1a hücre göçünün hedefsini hedefleyen bir yöntem açıklıyoruz. Primer murine B hücrelerinde gen indüksiyonu zorlu olabilir ve genellikle teknik bağlı olarak %10-20 oranında düşük transfeksiyon verimi verir. Burada primer murine B-1a hücrelerinin retroviral transdüksiyonunun %30-40 transdüksiyon verimi ile sonuçladığını gösterdik. Bu yöntem, donör B-1a hücre göçü ve lokalizasyonu görselleştirilebilmek için transduced B-1a hücrelerinin B hücresi eksikliği alıcı farelere benimseyen hücre transferini kullanır. Bu protokol diğer retroviral yapılar için değiştirilebilir ve donör hücre veya konak hücre fenotip ve fonksiyonunun analizi veya B-1a hücre transferi sonrası salgılanan çözünür faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel tahliller sonrası adoptive transfer, kullanılabilir. CD45.1 ve CD45.2 allotipi ile farklılaşan farklı donör ve alıcı farelerin kullanımı ve retroviral plazmid içinde bir GFP muhabirinin varlığı da endojen B hücre popülasyonları içeren diğer, bağışıklık-yeterli fare modellerinde donör hücrelerinin tespitini sağlayabilir.
Introduction
Son çalışmalar önemli bağışıklık hücresi göstermiştir, ve özellikle B hücre, henotypik ve fonksiyonel heterojenite hücre lokalizasyonuna bağlı olarak1,2,3,4,5. B-1a hücreleri koruyucu IgM antikorları üretmek için heterojen kapasiteye sahip tür bir popülasyondur; kemik iliği B-1a hücreleri igM salgılar ve plazma IgM titreleriönemliölçüde katkıda 6 , periton B-1a hücreleri homeostaz düşük seviyeli IgM salgısı varken ve bunun yerine doğuştan gelen ücretli reseptör ile aktive edilebilir (TLR) veya sitokin aracılı sinyal hızla çoğalmak için, göç, ve gizli IgM7,8,,90.10 B-1a hücreli IgM antikorları patojenlerde, apoptotik hücrelerde ve okside LDL’de bulunan oksidasyona özgü epitoplar (OSE) tanır ve OSE’ye bağlanan IgM, ateroskleroz11gibi hastalıklarda inflamatuar akıntı sinyalini önleyebilir. Bu nedenle, kemik iliği gibi bölgelere peritoneal B-1a hücre göçlerini artırarak IgM üretimini artırma stratejileri terapötik olarak yararlı olabilir. Ancak, bu tür stratejilerin hedef alınması ve hücre tipine özgü olması önemlidir, çünkü hedef dışı etkiler bağışıklık fonksiyonunu veya sağlığını olumsuz etkileyebilir.
Burada primer murine B-1a hücrelerinde CXCR4’ün hedefli ve uzun süreli aşırı ekspresyonu ve hücre göçünü ve fonksiyonel IgM antikor üretimini görselleştirmek için sonraki evlat edinici transfer için bir yöntem açıklıyoruz (Şekil 1). Birincil B hücrelerinin genetik manipülasyonu, dönüştürülmüş hücre hatlarının transfeksiyonu ile karşılaştırıldığında düşük transfeksiyon verimliliği ile sınırlıdır. Ancak, dönüştürülmüş hücre hatları önemli ölçüde birincil hücrelerden sapma olabilir12,13, birincil hücrelerin kullanımı daha yakından normal fizyolojisi hizalamak sonuçlar sağlamak olasıdır. Çeşitli teknikler retroviral transdüksiyon, adenoviral transdüksiyon, lipofection, ya da elektroporasyon tabanlı transfeksiyon, verimlilik, geçicilik değişen düzeylerde ve hücre sağlığı üzerinde etkisi13,,14,15dahil olmak üzere primer murine B hücrelerinde gen transferi için tanımlanmıştır. Aşağıdaki yöntemde retroviral transdüksiyon ,hücre canlılığını en az düzeyde etkilerken %gt;%30 oranında yeterli gen aktarım verimi vermiştir. CXCR4-ekspres retrovirüs daha önce açıklanan retroviral yapı murine kök hücre virüs-iç ribozomal giriş sitesi-yeşil floresan protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, içine fare CXCR4 gen alt klonlanmış olduğu4. MigR1 (kontrol(Ctl)-GFP) ve CXCR4-GFP retroviral partikülleri daha önce yayınlanmış protokollerde açıklandığı gibi kalsiyum fosfat transfeksiyonu kullanılarak üretildi4,14.
Başarılı bir şekilde transebed B-1a hücreleri daha sonra intravenöz lenfosit eksikliği Rag1-/- farelere transfer edildi. Hem donör hem de alıcı fareler ayrıca apolipoprotein E (ApoE) geninin nakavtını içeriyordu, bu da OSE birikiminin artması ve aterosklerozla sonuçlanarak in vivo B-1 hücre aktivasyonu ve IgM üretimi için bir model sağladı. Ayrıca, donör ve alıcı fareler CD45 allotype farklı; donör B-1 hücreleri CD45.1+ ApoE-/- farelerden geldi ve Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- alıcılarına transfer edildi. Bu, donör CD45.1’in alıcı CD45.2 B hücrelerinden akış sitometrisi analizi sırasında B hücre belirteçleri için ek olarak lekelemeye gerek kalmadan transfer sonrası farklılaşmasına olanak sağladı. Burada verilen sonuçlar, B-1a hücrelerinde hedeflenen CXCR4 aşırı ekspresyonu, B-1a hücrelerinin kemik iliğine geçiş yapma yeteneğini n arttırdığını ve bu da artmış plazma anti-OSE IgM ile ilişkilendirdiğini göstermektedir. Ayrıca negatif seçim yoluyla periton B-1 hücrelerinin zenginleştirilmesi için bir yöntem sağlamak ta ve verimli transdüksiyon için B-1 hücre aktivasyonu gereksinimini göstermektedir. Bu yöntem, protein aşırı ekspresyonunun B-1a hücre göçü, fenotip veya fonksiyon üzerindeki etkisini incelemek için diğer retroviral yapılara uyarlanabilir. Ayrıca, CD45.1 karşı CD45.2 allotype ayrım kullanımı teorik olarak endojen B hücreleri içeren diğer bağışıklık-yeterli murine modelleri ne transfer izin verebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sağlanan yöntem, kararlı ve nispeten verimli primer B-1a hücre gen idamı, in vivo adoptive transferi ve enjekte edilen hücrelerin tanımlanması ve lokalizasyonu sağlar. Hücreler hücre transferi sonrası 17 hafta saptandı ve artmış CXCR4 ekspresyonu tutuldu. Retrovirüs aracılı doğum, elelerimizdeki hücre canlılığı üzerinde en az etkiye sahip primer murine B-1a hücrelerinin %30-40 transdüksiyon verimi elde etti(Şekil 4e). Bu retroviral enfeksiyon, adenoviral en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) ve R01GM100776 (T.P. Bender) Proje 3 tarafından desteklenmiştir. A. Upadhye Amerikan Kalp Derneği Ön doktora bursu 16PRE30300002 ve 5T32AI007496-20 tarafından desteklendi. Biz Joanne Lannigan, Mike Solga ve Claude Chew Virginia Flow Cytometry Core Üniversitesi onların mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
