Opsono-bağlılık testi, antikorların aşı geliştirmedeki opsonik fonksiyonlarını değerlendirmek için opsono-fagositik öldürme testine alternatif bir yöntemdir.
Opsono-yapışma tahlili, bakteriyel patojenlerin profesyonel fagositlere bağlanmasını numaralayan işlevsel bir testtir. Fagositoz ve öldürme için bağlılık gerekli olduğundan, tahlil opsono-fagositik öldürme testlerine alternatif bir yöntemdir. Opsono-yapışma testinin bir avantajı, birden fazla deneyde standardizasyona izin veren inaktive patojenleri ve memeli hücre hatlarını kullanma seçeneğidir. Testte inaktive bir patojenin kullanılması, biyogüvenlik seviyesi 3 enfeksiyöz ajanlar ve diğer virülan patojenlerle çalışmayı da kolaylaştırır. Çalışmamızda, opsono-yapışmış test, şarbon kapsülü bazlı bir aşı ile aşılanmış hayvanların serasından, sabit Bacillus anthracis’in fare makrofaj hücresi hattı RAW 264.7’ye yapışmasını teşvik etmek için antikorların fonksiyonel yeteneğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Makrofajlara bağlı basil görüntülerini yakalamak için otomatik floresan mikroskopisi kullanıldı. Serumda anti-kapsül antikorlarının varlığı ile artan yapışlık ilişkiliydi. Yüksek serum anti-kapsül antikor konsantrasyonları sergileyen insan olmayan primatlar şarbon zorluğundan korundu. Bu nedenle, opsono-yapışıklık testi, seradaki antijen spesifik antikorların biyolojik işlevlerini aydınlatmak, aşı adaylarının ve diğer terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek ve bağışıklığın olası bir korelasyon olarak hizmet etmek için kullanılabilir.
Bir patojenin tanınması, yapışması, içselleştirilmesi ve bozulması fagositozun ayrılmaz bir parçasıdır 1 , ilk olarakIlyaMetchnikoff tarafından 1883’te tanımlanan konakçı doğuştan gelen immün yanıtta belirgin bir yol2,3. Fagositik lökositler ve bağışıklık sisteminin diğer hücreleri, hedef seçimlerinde son derece ayrımcıdır; patojen ilişkili moleküler desenler aracılığıyla “enfeksiyöz olmayan benlik” ile “enfeksiyöz olmayan benlik” arasında, örüntü tanıma reseptörleri (PRR) repertuarları (PRR)4,5ile ayırt edebiliyorlar. Bir patojenin konak tanıması, tamamlayıcı ve antikorlar gibi konak opsoninlerin bağlanmasıyla da ortaya çıkabilir6. Opsonizasyon adı verilen bu işlem, patojeni bu moleküllerle kaplar, fagositik hücreler üzerindeki opsonik reseptörlere (örneğin, kompleman ve Fc reseptörleri) bağlanması üzerine içselleştirmeyi artırır6. Bir patojenin bir fagositlere yapışması için, birden fazla reseptörün konyak ligandları ile kolektif olarak bağlanması gereklidir. Ancak o zaman içselleştirmeyi başlatmak için ana hücre içinde sinyal basamaklarını yapıştırma tetikleyicisi ve sürdürebilir6.
Patojenlerin temizlenmesinde ve enfeksiyonun önlenmesinde fagositozun önemi nedeniyle, hücre dışı patojenler hayatta kalmalarını uzatmak için bu süreci altüst etmenin birçok yolunu geliştirmiştir. Önemli bir strateji, yükü nedeniyle fagositik olmayan, zayıf immünojenik olan ve bakteriyel zarf üzerindeki molekülleri PRR6,7’denkoruyan bir anionik polimerik (örneğin, polisakkarit veya poliamino asit) kapsülünün üretimidir. Cryptococcus neoformans ve Streptococcus pneumoniae gibi patojenler sakkarit polimerlerden oluşan kapsüllere sahipken, Staphylococcus epidermidis ve bazı Bacillus türleri poli-ɣ glutamik asit (PGGA)7,8üretir. Yine de diğer patojenler bulaşıcı olmayan benliğe benzeyen kapsüller üretir. Örneğin, Streptococcus pyogenes ve B. cereus’un patojenik bir suşu, sadece fagositik olmayan, aynı zamanda bağışıklık sistemi tarafından yabancı olarak tanınmayabilecek bir hyaluronik asit kapsülüne sahiptir9,10.
Kapsülün taşıyıcı proteinlere konjugasyonu, onları zayıf, T-bağımsız antijenlerden, yüksek serum anti-kapsül antikor titrelerine neden olabilecek yüksek immünojenik T bağımlı antijenlere dönüştürür11,12. Bu strateji S. pneumoniae, Haemophilus influenzaeve Neisseria meningitides11’ekarşı lisanslı aşılar için kullanılır. Anti-kapsül antikorların opsonik aktiviteleri genellikle opsono-fagositik öldürme tahlilleri (OPKA)13 , 14,15,16ile değerlendirilmiştir. Bu tahliller fonksiyonel antikorların fagositozu tetikleyip tetikleyemeyeceği ve14. Bununla birlikte, OPKA’nın B. anthracis17de dahil olmak üzere Tier 1 Biyolojik Selani Ajanlar ve Toksinler (BSAT) gibi enfeksiyöz patojenlerle kullanımı tehlikelidir ve güvenlik riskleri sunar; bu tahliller, seçilmiş bir ajanın kapsamlı bir şekilde ele alınmasını gerektirir. Belirli ajan işleme sadece sınırlı biyogüvenlik seviye 3 (BSL-3) laboratuvarlarında yapılabilir; bu alanlarda çalışmak, uyulması gereken çok sayıda güvenlik ve emniyet önlemi nedeniyle uzun süreli çalışma prosedürleri talep eder. BSL-3 laboratuvarları da tipik olarak mikroskoplar ve sitometreler gibi OPKA çalışmaları için kullanılan özel ekipmanlarla donatılmamıştır. Böylece, inaktive bakteri kullanımına dayalı alternatif bir test geliştirdik18,19. Buna, içselleştirme ve öldürme tahlil çıktılarına bağlı olmayan bir opsono-bağlılık tahlil (OAA) olarak adlandırıyoruz; bunun yerine, opsonize inaktive patojenlerin yapışmışlığı fagositoz indeksi olarak kullanılır. Mekanistik olarak, OAA uygun bir alternatiftir, çünkü bağlılık bir priori meydana gelir ve içselleştirme ve hücre içi öldürme ile yakından iç içedir. Biyogüvenlik açısından bakıldığında, OAA enfeksiyöz bir ajanın minimum şekilde işlenmesini gerektirdiğinden, deneysel olarak OPKA’dan daha kısa süreli olduğundan ve inaktive patojen stoğu üretildikten ve aktarıldıktan sonra BSL-2 laboratuvarlarında gerçekleştirilebildiği için tercih edilir.
Neisseria meningitidlerinindış zar protein kompleksine (OMPC) konjuge edilen bir kapsül konjuge ile aşılanmış insan dışı primatların (NHP’ler) serasında bulunan anti-kapsül antikorlarının opsonik işlevini incelemek için OAA’nın kullanımını gösteriyoruz ]20. Serum opsonize basili, raw 264.7 adlı bir fare makrofaj hücre hattı ile inkübe edildi. Fiksasyondan sonra hücre monolayer ve yapışan basil floresan mikroskopi ile görüntülenmiştir. Bakteriyel yapışma, kapsül konjuge ile aşılanan NHP’lerden serum ile inkübe edildiğinde kontrol serumu20’yekıyasla artmıştır. Yapışlık şarbon mücadelesinin hayatta kalması ileilişkilidir 20,21. Bu nedenle, OAA kullanımı anti-kapsül antikorlarının işlevini karakterize etti ve aşı adayımızın testini büyük ölçüde kolaylaştırdı.
Kapsül bazlı aşıların çok sayıda bakteriyel patojene karşı etkili olduğu gösterilmiştir ve birçoğu insanlarda kullanım için lisanslıdır25,26,27. Bu aşılar kapsülü hedef alan antikorlar üreterek çalışır ve bu çalışmaların çoğu OPKA’yı13 , 14 , 16,28,29antikor…
The authors have nothing to disclose.
Yazıda açıklanan prosedürleri J. Chua, D. Chabot ve A. Friedlander tasarladı. Deneyleri J. Chua ve T. Putmon-Taylor yaptı. D. Chabot veri analizi yaptı. Taslağı J. Chua yazdı.
Yazarlar Kyle J. Fitts’e mükemmel teknik yardım için teşekkür ediyor.
Çalışma, Savunma Tehdit Azaltma Ajansı hibe CBM tarafından desteklendi. VAXBT.03.10.RD.015, plan numarası 921175.
Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve tavsiyeler yazarların görüşleridir ve mutlaka ABD Ordusu tarafından onaylanmamıştır. Bu yayının içeriği, Savunma Bakanlığı’nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmak zorunda değildir ve ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsedilmesi ABD Hükümeti tarafından onay anlamına gelmez.
0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |