Opsono-Adherence Assay для оценки функциональных антител в разработке вакцин против bacillus anthracis и других инкапсулированных патогенов

Признание, приверженность, интернализации и деградации патогена являются неотъемлемой^{частью фагоцитоза 1}, заметный путь в принимающей врожденный иммунный ответ впервые описан Илья Метчников в 1883^2,3. Фагоцитные лейкоциты, как и другие клетки иммунной системы, являются весьма дискриминационными в выборе целей; они способны различать “инфекционное не-я” и “неинфекционные самоуправления” через патогенные связанные молекулярные модели их репертуар рецепторов распознавания образов (PRRs)^4,5. Распознавание хозяина патогена может также происходить с связыванием опсонинов хозяина, таких как дополнение и антитела^6. Этот процесс, называемый опсонизацией, покрывает патоген этими молекулами, усиливая интернализации при связывании с опсоническими рецепторами (например, дополнять и Fc рецепторы) на фагоцитных клетках⁶. Для того, чтобы возбудитель придерживался фагоцита, необходимо коллективное связывание нескольких рецепторов с их лигандами cognate. Только тогда присоединение может вызвать и поддерживать сигнальные каскады внутри ячейки-хозяина, чтобы инициировать интернализацию^6.

В связи с важностью фагоцитоза в очистке патогенных микроорганизмов и профилактике инфекции, внеклеточные патогены разработали множество способов подорвать этот процесс, чтобы продлить их выживание. Одной из стратегий важности является производство анионовой полимерной (например, полисахаридной или полиаминовой кислоты) капсулы, которая является антифагоцитной в силу своего заряда, плохо иммуногенной, и защищает молекулы на бактериальной оболочке от PRRs^6,7. Патогенные микроорганизмы, такие как Cryptococcus neoformans и Streptococcus pneumoniae имеют капсулы, состоящие из сахаридных полимеров, в то время как стафилококк эпидермидис и некоторые виды Bacillus производят поли-ɣ-глутамовую кислоту (PGGA)^7,8. Тем не менее, другие патогены производят капсулы, которые напоминают неинфекционные самоуправления. Например, стрептококк пиогены и патогенный штамм B. cereus имеют капсулу гиалуроновой кислоты, которая является не только антифагоцитной, но которые также не могут быть признаны иностранными^{иммунной системой 9,10}.

Спряжение капсулы для носителя белков преобразует их из бедных, T-независимых антигенов в высоко иммуногенных Т-зависимых антигенов, которые могут вызвать высокую сыворотку анти-капсулы антитела титеры^11,12. Эта стратегия используется для лицензированных вакцин против S. pneumoniae, Haemophilus influenzae, и Neisseria meningitides¹¹. Опсонные действия анти-капсулы антител, как правило, были оценены опсоно-фагоцитических анализов убийства (OPKA)^13,14,15,16. Эти анализы тест ли функциональные антитела могут вызвать фагоцитоз и убийство¹⁴. Тем не менее, использование OPKA с инфекционными патогенами, такими как Tier 1 Биологические выберите агентов и токсинов (BSAT), в том числе B. anthracis¹⁷, является опасным и представляет угрозу безопасности; эти анализы требуют тщательного обращения с выбранным агентом. Обработка выбора агента может быть выполнена только в лабораториях ограниченного уровня биобезопасности 3 (BSL-3); работа в этих областях требует длительных оперативных процедур в связи с многочисленными мерами предосторожности и безопасности, которые необходимо соблюдать. Лаборатории BSL-3 также, как правило, не оснащены специализированным оборудованием, используемым для работы OPKA, таким как микроскопы и цитометры. Таким образом, мы разработали альтернативный анализ, основанный на использовании инактивированных^{бактерий 18,19}. Мы называем это анализом о приверженности опсоно (ОАА), который не зависит от интернализации и убийства в результате анализа; вместо этого, соблюдение опсонизированных инактивированных патогенов используется в качестве индекса фагоцитоза. Механистически, OAA является подходящей заменой, потому что соблюдение происходит априори и тесно переплетается с интернализации и внутриклеточного убийства. С точки зрения биобезопасности, ОАА является предпочтительным, поскольку она требует минимальной обработки инфекционного агента, экспериментально короче, чем OPKA, и может быть выполнена в лабораториях BSL-2 после того, как запас инактивированного патогена был произведен и передан.

Мы демонстрируем использование OAA для изучения опсонной функции анти-капсулы антител, найденных в сыворотке не-человеческих приматов (NHPs) вакцинированы с капсулой конъюгировать (т.е. PGGA от B. anthracis спрягается с внешней мембраны белкового комплекса (OMPC) neisseria менингита^{No 20}. Сыворотка opsonized бациллы были инкубированы с приверженцем мыши макрофаг клеточной линии, RAW 264.7. После фиксации, монослой клеток и адепт бациллы были изображены с помощью микроскопии флуоресценции. Бактериальное присоединение увеличилось, когда бациллы были инкубированы сывороткой из NHPs вакцинированы капсулы конъюгировать по сравнению с контролем^{сыворотки 20}. Соблюдение коррелирует с выживанием сибирской язвы^{вызов 20,21}. Таким образом, использование ОАА характеризовало функцию антител против капсулы и значительно облегчило тестирование нашего кандидата вакцины.