Summary

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining come strumento per scoprire nuovi prodotti naturali

Published: March 12, 2020
doi:

Summary

Un protocollo di estrazione del genoma guidato dalla spettrometria di massa è stabilito e descritto qui. Si basa sulle informazioni sulla sequenza genomica e sull’analisi LC-MS/MS e mira a facilitare l’identificazione di molecole da complessi estratti microbici e vegetali.

Abstract

Lo spazio chimico coperto da prodotti naturali è immenso e ampiamente non riconosciuto. Pertanto, sono desiderate metodologie convenienti per eseguire una valutazione ad ampio raggio delle loro funzioni in natura e potenziali benefici umani (ad esempio, per applicazioni di scoperta di farmaci). Questo protocollo descrive la combinazione di estrazione del genoma (GM) e networking molecolare (MN), due approcci contemporanei che corrispondono alle annotazioni con codifica a cluster genico nel sequenziamento dell’intero genoma con le firme della struttura chimica da estratti metabolici grezzi. Questo è il primo passo verso la scoperta di nuove entità naturali. Questi concetti, se applicati insieme, sono qui definiti come estrazione genomica guidata da MS. In questo metodo, i componenti principali sono designati in precedenza (utilizzando MN) e i nuovi candidati strutturalmente correlati sono associati alle annotazioni della sequenza del genoma (utilizzando GM). La combinazione di GM e MN è una strategia redditizia per colpire nuove spinadorsali molecolari o raccogliere profili metabolici al fine di identificare analoghi da composti già noti.

Introduction

Le indagini sul metabolismo secondario spesso consistono nello screening di estratti grezzi per specifiche attività biologiche seguite da purificazione, identificazione e caratterizzazione dei costituenti appartenenti a frazioni attive. Questo processo si è dimostrato efficiente, promuovendo l’isolamento di diverse entità chimiche. Tuttavia, al giorno d’oggi questo è visto come irrealizzabile, principalmente a causa degli alti tassi di riscoperta. Come l’industria farmaceutica rivoluzionato senza conoscenza dei ruoli e le funzioni di metaboliti specializzati, la loro identificazione è stata effettuata in condizioni di laboratorio che non rappresentavano con precisione la natura1. Oggi, c’è una migliore comprensione delle influenze di segnalazione naturale, secrezione, e la presenza della maggior parte degli obiettivi a concentrazioni non rilevabili basse. Inoltre, la regolamentazione del processo aiuterà la comunità accademica e l’industria farmaceutica a trarre vantaggio da queste conoscenze. Ne beneficeranno anche la ricerca che coinvolgerà l’isolamento diretto dei metaboliti legati ai cluster genici biosintetici silenziosi (BCC)2.

In questo contesto, i progressi nel sequenziamento genomico hanno rinnovato l’interesse per i metaboliti dei microrganismi di screening. Questo perché l’analisi delle informazioni genomiche degli ammassi biosintetici scoperti può rivelare geni che codificano nuovi composti non osservati o prodotti in condizioni di laboratorio. Molti progetti o correnti d’aria microbici dell’intero genoma sono oggi disponibili, e il numero è in crescita ogni anno, fornendo enormi prospettive per scoprire nuove molecole bioattive attraverso l’estrazione del genoma3,4.

L’Atlante dei cluster di geni biosintetici è la più grande collezione di cluster genici estratti automaticamente come componente della piattaforma integrata dei genomi microbici del Joint Genome Institute (JGI IMG-ABC)2. Più recentemente, la Minimum Information for Biosynthetic Gene Clusters (MIBiG) Standardization Initiative ha promosso la riannotazione manuale dei BMC, fornendo un set di dati di riferimento altamente curato5. Al giorno d’oggi, sono disponibili molti strumenti per consentire l’estrazione computazionale dei dati genetici e la loro connessione ai metaboliti secondari noti. Sono state inoltre sviluppate diverse strategie per accedere a nuovi prodotti naturali bioattivi (ad esempio, espressione etetologa, cancellazione genica mirata, ricostituzione in vitro, sequenza genomica, screening guidato da isotopi [approccio genomitopico], manipolazione delle autorità di regolamentazione locali e globali, estrazione basata su target di resistenza, estrazione indipendente dalla cultura e, più recentemente, approccio al codiceMS 2,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15).

L’estrazione del genoma come strategia singolare richiede sforzi per annotare un singolo o un piccolo gruppo di molecole; pertanto, permangono lacune nel processo in cui i nuovi composti sono prioritari per l’isolamento e la chiarificazione della struttura. In linea di principio, questi approcci si rivolgono a un solo percorso biosintetico per esperimento, con conseguente rallentamento del tasso di scoperta. In questo senso, l’utilizzo di GM insieme a un approccio di rete molecolare rappresenta un importante progresso per la ricerca sui prodotti naturali14,15.

La versatilità, la precisione e l’elevata sensibilità della spettrometria cromatografica-massa liquida (LC-MS) lo rendono un buon metodo per l’identificazione composta. Attualmente, diverse piattaforme hanno investito algoritmi e suite software per metabolomica non mirata16,17,18,19,20.20 Il nucleo di questi programmi include il rilevamento delle funzionalità (picco di raccolta)21 e l’allineamento di picco, che consente la corrispondenza di funzionalità identiche in un batch di campioni e la ricerca di modelli. Gli algoritmi basati su modelli MS22,,23 confrontano i modelli di frammentazione caratteristici e corrispondono alle somiglianze ms2 generando famiglie molecolari che condividono caratteristiche strutturali. Queste caratteristiche possono quindi essere evidenziate e raggruppate, conferendo la capacità di scoprire rapidamente molecole note e sconosciute da un complesso estratto biologico in tandem MS2,24,25. Pertanto, la SM in tandem è un metodo versatile per ottenere informazioni strutturali su diversi chemiotipi contenuti contemporaneamente in una grande quantità di dati.

L’algoritmo Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)26 utilizza l’intensità degli ioni di frammento normalizzati per costruire vettori multidimensionali, in cui le somiglianze vengono confrontate utilizzando una funzione coseno. La relazione tra i diversi ioni padre viene tracciata in una rappresentazione del diagramma, in cui ogni frammentazione viene visualizzata come nodo (cerchi) e la correlazione di ogni nodo è definita da uno spigolo (linee). La visualizzazione globale delle molecole provenienti da un’unica fonte è definita come una rete molecolare. Molecole strutturalmente divergenti che si frammentano in modo univoco formeranno il proprio ammasso o costellazione specifica, mentre le molecole correlate si raggruppano. I chemiotipi di clustering consentono l’ipotetica connessione di caratteristiche strutturali simili alle loro origini biosintetiche.

La combinazione di approcci chemiotipo-genotipo e genotipo è potente quando si creano collegamenti bioinformatici tra BCC e i loro piccoli prodotti molecolari27. Pertanto, l’estrazione del genoma guidata dalla MS è un metodo rapido e una strategia a basso consumo di materiali e aiuta a colmare gli ioni dei genitori e le vie biosintetiche rivelate dal WGS di uno o più ceppi in diverse condizioni metaboliche e ambientali.

Il flusso di lavoro di questo protocollo (Figura 1) consiste nell’inserire i dati WGS in una piattaforma di annotazione del cluster di geni biosintetici come antiSMASH28,29,30. Aiuta a stimare la varietà di composti e la classe di composti codificati dal genoma. Deve essere adottata una strategia per colpire un cluster di geni biosintetici che codifica un’entità chimica di interesse, e gli estratti di coltura da un ceppo di tipo selvaggio e/o ceppo eteboloso contenente il BGC possono essere analizzati per generare ioni raggruppati in base alle somiglianze utilizzando GNPS26,31. Di conseguenza, è possibile identificare nuove molecole che si associano al BGC mirato e non sono disponibili nel database (principalmente analoghi sconosciuti, a volte prodotti in elementi bassi). È importante considerare che gli utenti possono contribuire a queste piattaforme e che la disponibilità di bioinformatica e dati MS/MS sta aumentando rapidamente, spingendo a uno sviluppo costante e l’aggiornamento di strumenti e algoritmi computazionali efficaci per guidare connessioni efficienti di estratti complessi con molecole.

Figure 1
Figura 1: Panoramica dell’intero flusso di lavoro. È mostrato un’illustrazione delle fasi bioinformatiche, clonazione e networking molecolare coinvolte nell’approccio descritto nell’estrazione del genoma guidato dalla Ms per identificare nuovi metaboliti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro rapido ed efficiente per combinare l’estrazione del genoma e la rete molecolare come punto di partenza per la pipeline di scoperta naturale dei prodotti. Anche se molte applicazioni sono in grado di visualizzare la composizione e la relatedness delle molecole rilevabili dalla MS in una rete, diverse sono adottate qui per visualizzare molecole raggruppate strutturalmente simili. Utilizzando questa strategia, vengono identificati con successo nuovi prodotti ciclodepsipeptide osservati negli estratti metabolici di Streptomyces sp. CBMAI 2042. Guidato dall’estrazione del genoma, l’intera codifica del cluster genico biosintetico per le valiomiciche è riconosciuta e clonata nel ceppo produttore Streptomices coelicolor M1146. Infine, a seguito di una rete molecolare basata su modelli di SM, le molecole rilevate dalla SM sono correlate con i BMC responsabili della loro biogenesi32.

Protocol

1. Estrazione del genoma per cluster genici biosintetici Eseguire il sequenziamento dell’intero genoma (WGS) come primo passo per eleggere un cluster genico biosintetico (BCG) per l’estrazione del genoma guidata dalla MS. L’intero genoma del ceppo di interesse (batteri) può essere ottenuto dalla tecnologia Illumina MiSeq utilizzando quanto segue con DNA genomico di alta qualità: fucile TruSeq PCR-Free library prep e Nextera Mate Pair Library Preparation Kit33.NOTA: dopo la sequenza…

Representative Results

Il protocollo è stato esemplificato con successo utilizzando una combinazione di estrazione del genoma, espressione etetologa e approcci MS-guidato/codice per accedere a nuove molecole specializzate di analoghi di valinomicina. Il flusso di lavoro genoma-molecola per il bersaglio, la valiomicina (VLM), è rappresentato nella Figura 8. Il genoma del progetto CBMAI 2042 è stato analizzato in silico e il cluster genico VLM è stato quindi identificato e trasferito in un ospite etelog…

Discussion

Il vantaggio più forte di questo protocollo è la sua capacità di dereplicare rapidamente i profili metabolici e le informazioni genomiche del ponte con i dati MS al fine di chiarire le strutture di nuove molecole, in particolare analoghi strutturali2. Sulla base di informazioni genomiche, è possibile studiare chemiotipi di prodotti naturali diversi, come i polionidi (PK), i peptidi non ribonsuici (NRP) e i prodotti naturali glicosillati (GNP), nonché gli screening metabolomici criptici. Così…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il sostegno finanziario a questo studio è stato fornito dalla Fondazione ricerca di San Paolo – FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 e 2014/50249-8 a L.G.O; 2013/12598-8 e 2015/01013-4 a R.S.; e 2019/08853-9 a C.F.F.A). B.S.P, C.F.F.A. e L.G.O. hanno ricevuto borse di studio dal Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico – CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4 e 313492/2017-4). L.G.O. è anche grato per il sostegno alla borsa di studio fornito dal programma For Women in Science (2008, edizione brasiliana). Tutti gli autori riconoscono CAPES (Coordinamento per il Miglioramento del Personale per l’Istruzione Superiore) per aver sostenuto i programmi post-laurea in Brasile.

Materials

Acetonitrile Tedia AA1120-048 HPLC grade
Agar Oxoid LP0011 NA
Apramycin Sigma Aldrich A2024 NA
Carbenicillin Sigma Aldrich C9231 NA
Centrifuge Eppendorf NA 5804
Chloramphenicol Sigma Aldrich C3175 NA
Column C18 Agilent Technologies NA ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902
Kanamycin Sigma Aldrich K1377 NA
Manitol P.A.- A.C.S. Synth NA NA
Microcentrifuge Eppendorf NA 5418
Nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 NA
Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix ThermoFisher Scientific F548S NA
Q-TOF mass spectrometer Agilent technologies NA 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS
Sacarose P.A.- A.C.S. Synth NA NA
Shaker/Incubator Marconi MA420 NA
Sodium Chloride Synth NA P. A. – ACS
Soy extract NA NA NA
Sucrose Synth NA P. A. – ACS
Thermal Cycles Eppendorf NA Mastercycler Nexus Gradient
Thiostrepton Sigma Aldrich T8902 NA
Tryptone Oxoid LP0042 NA
Tryptone Soy Broth Oxoid CM0129 NA
UPLC Agilent Technologies NA 1290 Infinity LC System
Yeast extract Oxoid LP0021 NA

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Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products. J. Vis. Exp. (157), e60825, doi:10.3791/60825 (2020).

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