המסה ספקטרומטר מודרמטריה מונחה הגנום ככלי לחשוף מוצרים טבעיים הרומן

חקירת חילוף החומרים המשני מורכבת לעתים קרובות מסינון תמציות גולמי לפעילות ביולוגית מסוימת ולאחריה טיהור, זיהוי ואפיון של המרכיבים השייכים לשברים פעילים. תהליך זה הוכיח כיעיל, ומקדם את הבידוד של מספר ישויות כימיות. עם זאת, כיום זה נראה בלתי אפשרי, בעיקר בשל שיעור גבוה של גילוי מחדש. כמו תעשיית התרופות מהפכה ללא ידיעת תפקידים ופונקציות של מטבוליטים מיוחדים, הזיהוי שלהם בוצע בתנאי מעבדה שלא מייצגים במדויק את הטבע¹. כיום, יש הבנה טובה יותר של השפעות האיתות הטבעי, הפרשה, ואת הנוכחות של רוב היעדים בריכוזים נמוכים באופן בלתי סביר. בנוסף, התקנת התהליך תסייע לקהילה האקדמית ולתעשייה הפרמצבטית לנצל את הידע הזה. זה יהיה גם ליהנות מחקר הכרוך בבידוד ישיר של מטבוליטים הקשורים אשכולות גנים ביולוגיים שקטים (BGCs)².

בהקשר זה, ההתקדמות ברצף גנומית יש עניין מחודש בהקרנה מיקרואורגניזם מטבוליטים. זה בגלל ניתוח מידע גנומי של אשכולות ביולוגיים חשף יכול לחשוף גנים קידוד תרכובות הרומן לא נצפתה או מופק בתנאי מעבדה. פרויקטים רבים של הגנום מחיידקים או טיוטות זמינים היום, ואת המספר גדל מדי שנה, מתן סיכויים מסיבי לגילוי מולקולות אקטיביים הרומן דרך כריית^{3הגנום 3,4}.

האטלס של ביוסינתטי אשכולות גנים הוא האוסף הנוכחי הגדול ביותר של כבוש באופן אוטומטי אשכולות גנים כרכיב של פלטפורמת חיידקים משולבים Genomes של הגנום משותף המכון (JGI IMG-ABC)². לאחרונה, את המידע המינימלי עבור אשכולות גנים Biosynthetic (MIBiG) היוזמה לקדם את הביאור הידני של BGCs, מתן התייחסות באופן מאוד משמעותי לערכת נתונים⁵. כיום, שפע של כלים זמינים כדי לאפשר כרייה חישובית של נתונים גנטיים ואת הקשר שלהם הידוע מטבוליטים משני. אסטרטגיות שונות פותחו גם כדי גישה מוצרים טבעיים אקטיביים החדש (כלומר, ביטוי הטרוולוגי, מחיקת גנים היעד, באופן מתורבת החוקה, רצף גנומית, איזוטופ מונחה ההקרנה [genomisotopic גישה], מניפולציה של ורגולטורים מקומיים וגלובליים, התנגדות מבוסס היעד הכרייה, תרבות הכרייה עצמאית, ו, לאחרונה, MS-מונחה/קוד גישות^{2,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15}).

כריית הגנום כאסטרטגיה יחיד דורש מאמצים כדי להוסיף קבוצה אחת או קטנה של מולקולות; לפיכך, הפערים בתהליך נותרים, בהם תרכובות חדשות מעדיפות לבידוד ומבנה. בעיקרון, גישות אלה מתמקדות רק מסלול ביו-סינתטי אחד לכל ניסוי, ובכך התוצאה היא שיעור גילוי איטי. במובן זה, שימוש ב-GM יחד עם גישה לרשת מולקולרית מייצג מקדמה חשובה עבור מחקר המוצר הטבעי^14,15.

רב-תכליתיות, דיוק, ורגישות גבוהה של הספקטרומטר כרומטוגרפיה נוזלי (LC-MS) להפוך אותו שיטה טובה לזיהוי מורכב. כיום, מספר פלטפורמות השקיעו אלגוריתמים וחבילות תוכנה עבור טבולומיקס ממוקדות^{16,17,18,19,20}. הליבה של תוכניות אלה כוללת זיהוי תכונות (שיא איסוף)²¹ ויישור שיא, אשר מאפשר התאמה של תכונות זהות על גבי קבוצה של דגימות וחיפוש דפוסים. MS מבוססי דפוס אלגוריתמים^{22, 23 להשוות23} דפוסי פיצול אופייני ולהתאים MS² קווי דמיון יצירת משפחות מולקולריות שיתוף תכונות מבניות. תכונות אלה יכולים להיות מודגשים ומקובצים באשכולות, הענקת היכולת לגלות במהירות מולקולות ידועות ובלתי ידועות מתוך תמצית ביולוגית מורכבת על ידי זוג^{שני MS,24,25}. לכן, במקביל MS היא שיטה רב-תכליתית כדי לצבור מידע מבני מספר כימוסוגים הכלולים בכמות גדולה של נתונים בו זמנית.

האלגוריתם הגלובלי של מוצרים טבעיים (GNPS)²⁶ משתמש בעוצמה המנורמלת של יוני השבר כדי לבנות וקטורים רב-ממדיים, שבהם ההשוואה משולה באמצעות פונקציית קוסינוס. הקשר בין יוני הורים שונים מותווים בייצוג בדיאגרמה, בו כל פיצול מוגדר כצומת (עיגולים), והשוליים החוזרים של כל צומת מוגדרים על-ידי קצה (קווים). ההדמיה הגלובלית של מולקולות ממקור אחד מוגדרת כרשת מולקולרית. מולקולות מתבשמות שרסיס באופן ייחודי יוצרות את האשכול או קבוצת הכוכבים הספציפיים שלהם, ואילו מולקולות קשורות מצרר יחד. סוגי כימוא של האשכולות מאפשר חיבור היפותטי של תכונות מבניות דומות למקורות הביוסינתטיים שלהם.

שילוב הן כימוסוג-אל-גנוטיפ וגישות גנוטיפ-אל-כימוסוג היא רבת עוצמה בעת יצירת קישורים בביואינפורמטיקה בין BGCs ומוצרים קטנים שלהם מולקולה²⁷. לכן, MS-מונחה הגנום הכרייה היא שיטה מהירה והאסטרטגיה הנמוכה צורכת חומר, והוא מסייע בגשר יוני הורים מסלולים biosynthetic שנחשף על ידי WGS של אחד או יותר זנים תחת מגוון תנאים סביבתיים מטבולית.

זרימת העבודה של פרוטוקול זה (איור 1) כוללת האכלה של נתוני wgs לתוך פלטפורמת ביאור לאשכול גנים ביוסינתטיים כגון antismash^28,29,30. זה עוזר להעריך את מגוון תרכובות ומעמד של תרכובות מקודד על ידי הגנום. אסטרטגיה כדי למקד את האשכולות גנים biosynthetic קידוד ישות כימית של עניין חייב להיות מאומץ, ותמציות התרבות מתוך זן סוג פראי ו/או זן הטרוולוגי המכיל את bgc ניתן לנתח כדי ליצור יונים מקובצים בהתבסס על קווי דמיון באמצעות gnps^26,31. כתוצאה מכך, ניתן לזהות מולקולות חדשות המשייכים למוקד ה-BGC המיועד ואינן זמינות במסד הנתונים (בעיקר מקבילים לא ידועים, המיוצרים לעתים בפתיתים נמוכים). זה רלוונטי לשקול כי משתמשים יכולים לתרום פלטפורמות אלה וכי הזמינות של ביואינפורמטיקה ו-MS/MS נתונים גדל במהירות, נהיגה לפיתוח קבוע ושדרוג של כלים חישוביים יעילים ואלגוריתמים כדי להנחות התקשרויות יעילות של תמציות מורכבות עם מולקולות.

איור 1: מבט כולל על זרימת העבודה כולה. מוצג הוא איור של שלבי ביוטכנולוגיה, שיבוט, והתקשורת המולקולרית מעורבים גישה מונחה הגנום MS-מודרך כדי לזהות מטבוליטים חדשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מהירה ויעילה כדי לשלב את כריית הגנום ואת הרשת המולקולרית כנקודת התחלה של צינור גילוי המוצר הטבעי. למרות יישומים רבים מסוגלים להמחיש את הרכב ומחדש של מולקולות לזיהוי MS ברשת אחת, מספר מאומצים כאן כדי להמחיש באופן מבנית מולקולות באשכולות דומים. באמצעות אסטרטגיה זו, מוצרים cyclodepsipeptide הרומן נצפתה בתמציות מטבולית של Streptomyces SP. CBMAI 2042 מזוהים בהצלחה. מודרך על ידי כריית הגנום, כל האשכולות גנים biosynthetic כל הקידוד עבור valinomycins הוא מוכר ומשוכפל לתוך זן המפיק Streptomyces co olor M1146. בסופו של דבר, בעקבות רשת מולקולרית המבוסס על תבנית MS, המולקולות שזוהו על ידי MS הם בקורלציה עם BGCs אחראי על biogenesis³²שלהם.