Summary

Utilisation d'un analyseur de flux extracellulaire pour mesurer les changements dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris

Published: January 22, 2020
doi:

Summary

Nous décrivons l’application d’un analyseur extracellulaire de flux pour surveiller des changements en temps réel dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris.

Abstract

Le sperme de mammifères acquiert la capacité de fertilisation dans l’appareil reproducteur femelle dans un processus connu sous le nom de capacitation. Les processus associés à la capacitation nécessitent de l’énergie. Il reste un débat continu au sujet des sources générant l’ATP qui alimente la motilité progressive de sperme, la capacitation, l’hyperactivation, et la réaction acrosome. Ici, nous décrivons l’application d’un analyseur extracellulaire de flux comme outil pour analyser des changements dans le métabolisme énergétique pendant la capacitation de sperme de souris. À l’aide de het O2– fluorophores sensibles, cette méthode permet de surveiller la glycolyse et la phosphorylation oxydative en temps réel chez les spermatozoïdes non capacitated versus capacitating. L’utilisation de cet analyse en présence de différents substrats énergétiques et/ou d’activateurs pharmacologiques et/ou d’inhibiteurs peut fournir des informations importantes sur la contribution de différentes voies métaboliques et l’intersection entre les cascades de signalisation et le métabolisme pendant la capacitation des spermatozoïdes.

Introduction

L’application de la spectrométrie de masse a révolutionné l’étude du métabolisme. Le profilage métabolique ciblé et le traçage métabolomique permettent une surveillance précise des changements dans le métabolisme énergétique. Cependant, l’exécution de la métabolomique nécessite une formation approfondie, un personnel expérimenté et des spectromètres de masse coûteux et très sensibles qui ne sont pas facilement accessibles à tous les laboratoires. Ces dernières années, l’utilisation d’un analyseur de flux extracellulaire, comme l’hippocampe XFe96 est devenu populaire comme une méthode de substitution pour mesurer les changements dans le métabolisme énergétique dans divers types de cellules1,2,3,4,5.

Les spermatozoïdes sont des cellules motiles hautement spécialisées; dont la tâche est de livrer le génome paternel à l’ovocyte. Les spermatozoïdes quittant l’appareil reproducteur masculin après l’éjaculation sont encore fonctionnellement immatures et ne peuvent pas féconder l’ovocyte parce qu’ils sont incapables de pénétrer les vêtements des ovocytes. Le sperme acquiert la compétence de fertilisation pendant qu’ils transitent par l’appareil reproducteur femelle dans un processus de maturation connu sous le nom de capacitation6,7. Les spermatozoïdes ou spermatozoïdes fraîchement éjaculés disséqués de l’épididyme cauda peuvent être concoctées in vitro par incubation dans des supports de capacitation définis contenant Ca2,bicarbonate (HCO3) ou un analogue cAMP perméable à la cellule (p. ex., dibutyryl-cAMP), un accepteur de cholestérol (p. ex. albumine de sérum bovin, BSA) et une source d’énergie (p. ex. glucose). Pendant la capacitation, les spermatozoïdes modifient leur modèle de motilité en un battement asymétrique de flagellaire, représentant un mode de natation appelé hyperactivation8,9, et ils deviennent compétents pour subir la réaction acrosome7, où des enzymes protéolytiques sont libérées qui digèrent les vêtements des ovocytes. Ces processus nécessitent de l’énergie, et similaires aux cellules somatiques, les spermatozoïdes génèrent de l’ATP et d’autres composés à haute énergie par glycolyse ainsi que le cycle mitochondrial TCA et la phosphorylation oxydative (oxphos)10. Tandis que les études multiples démontrent que la glycolyse est nécessaire et suffisante pour soutenir la capacitation de sperme11,12,13,14, la contribution de l’oxphos est moins claire. Contrairement à d’autres types de cellules où la glycolyse est physiquement couplée au cycle TCA, les spermatozoïdes sont très compartimentés et sont pensés pour maintenir ces processus dans des compartiments de flagellateur séparés: la pièce médiane concentre la machinerie mitochondriale, tandis que les enzymes clés de la glycolyse semblent être limitées à la pièce principale15,16. Cette compartimentation se traduit par un débat en cours sur la question de savoir si le pyruvate produit dans la pièce principale par glycolyse peut soutenir les oxphos mitochondriaux dans la pièce médiane, et si l’ATP produit par les oxphos dans la pièce médiane serait en mesure de diffuser suffisamment rapidement le long de la longueur du flagellum pour soutenir les besoins énergétiques dans les parties distales de la pièce principale17,18,19. Il y a également le soutien d’un rôle pour des oxphos dans la capacitation de sperme. Non seulement les oxphos sont plus favorables énergétiquement que la glycolyse, générant 16 fois plus d’ATP que la glycolyse, mais le volume médian et la teneur mitochondriale sont directement corrélés avec la forme reproductive chez les espèces de mammifères qui présentent de plus grands degrés de concurrence entre les mâles pour les compagnons20. Pour répondre à ces questions, il faut des méthodes pour examiner les contributions relatives de la glycolyse et de l’oxphos pendant la capacitation des spermatozoïdes.

Tourmente et coll. ont appliqué un analyseur de flux extracellulaire de 24 puits pour comparer le métabolisme énergétique d’espèces de souris étroitement apparentées avec des paramètres de performance des spermatozoïdes significativement différents21. Au lieu de rapporter les valeurs basales d’ECAR et d’OCR des spermatozoïdes non-capacitated, ici, nous adaptons leur méthode utilisant un analyseur extracellulaire de flux de 96-bien pour surveiller des changements dans le métabolisme énergétique pendant la capacitation de sperme de souris en temps réel. Nous avons développé une méthode qui permet de surveiller simultanément la glycolyse et les oxphos en temps réel dans les spermatozoïdes avec battre flagelle dans jusqu’à douze conditions expérimentales différentes en mesurant le flux d’oxygène (O2) et les protons (H)(Figure 1A). En raison de la décomposition du pyruvate à lactate pendant la glycolyse et de la production de CO2 via le cycle TCA, les spermatozoïdes non capacitatisés et concitatisés extrudent Hdans le support d’analyse qui sont détectés par l’analyseur de flux extracellulaire par l’intermédiaire des fluorophoressensiblesH-sensibles immobilisés à l’extrémité de la sonde d’une cartouche de capteur. En parallèle, la consommation d’O2 par phosphorylation oxydative est détectée par l’intermédiaire de fluorophores sensibles à l’O2immobilisés à la même pointe de la sonde (Figure 1B). La détection efficace de l’O2 libéréet consommé nécessite un tampon de sperme modifié avec une faible capacité tampon sans bicarbonate ou rouge phénol. Ainsi, pour induire la capacitation en l’absence de bicarbonate, nous avons adopté l’utilisation d’un analogue cAMP perméable à la cellule injecté avec l’inhibiteur de la PDE à large portée IBMX22. Trois autres ports d’injection indépendants permettent l’injection d’activateurs pharmacologiques et/ou d’inhibiteurs, ce qui facilite la détection en temps réel des changements dans la respiration cellulaire et le taux de glycolyse dus à la manipulation expérimentale.

Protocol

Le sperme est recueilli à partir de souris mâles CD-1 de 8-16 semaines. Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de Weill Cornell Medicine. 1. Jour avant l’assay Préparation de la cartouche de capteur et de l’analyseur de flux extracellulaire calibrant Pour hydrater la cartouche du capteur, retirez la cartouche du capteur du kit d’assiduité extracellulaire XFe96 e…

Representative Results

Cette méthode utilise un analyseur de flux extracellulaire pour surveiller les changements en temps réel dans le taux de glycolyse et d’oxphos pendant la capacitation de sperme de souris. La figure 4 montre une expérience exemplaire où les spermatozoïdes ont été concités en présence de glucose comme seul substrat énergétique et 2-DG et antimycine et rotenone comme modulateurs pharmacologiques. Le substrat d’énergie dans le tampon d’analyseur de fl…

Discussion

La perte de la capacitation de sperme en l’absence de certains substrats métaboliques ou enzymes métaboliques critiques a indiqué le métabolisme d’énergie comme facteur clé soutenant la fertilisation réussie. Un commutateur métabolique pendant l’activation cellulaire est un concept bien établi dans d’autres types de cellules, cependant, nous commençons juste à comprendre comment les spermatozoïdes adaptent leur métabolisme à la demande croissante d’énergie pendant la capacitation. À l’aide d’un analyseur …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à souligner le soutien du Dr Lavoisier Ramos-Espiritu au Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.

Materials

Reagents
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375 2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I7018 IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A1470 BSA
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) Sigma-Aldrich L7381 ConA
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Hepes Sigma-Aldrich H0887
Isothesia Henry Schein Animal Health 1169567761 Isoflurane
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt Sigma-Aldrich D0627 db-cAMP
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333 KCl
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P5655 KH2PO4
Rotenone Cayman Chemical Company 13995 Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3-
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888 NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μL eppendorf ES-12-100
12 channel pipette 50-300 μL vwr 613-5257
37 °C, non-CO2 incubator vwr 1545
5 mL cetrifuge tubes eppendorf 30119380
50 mL conical centrifuge tubes vwr 76211-286
Centrifuge with plate adapter Thermo Scientific IEC FL40R
Dissection kit World Precision Instruments MOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objective Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided Thomas Scientific 1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided Thomas Scientific 1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.

References

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Cite This Article
Balbach, M., Buck, J., Levin, L. R. Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation. J. Vis. Exp. (155), e60815, doi:10.3791/60815 (2020).

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