Agrobacterium- Trasformazione dell'embrione immaturo mediato delle linee inbrete di mais recalcitranti utilizzando geni morfogenici

1. Preparazione dei media di crescita Per le ricette medie di crescita esatte per questo protocollo, si prega di fare riferimento alla Tabella 1. Per preparare 1 L di supporti, mettere un becher da 2 L su un piatto di mescolare e mettere una barra di mescolare all’interno. Riempire il becher con 900 mL di acqua distillata e accendere la piastra di mescolare. La barra di agitazione dovrebbe girare a velocità media. Pesare tutti gli ingredienti in polvere e sciogliere in un bicchiere. Misurare tutti gli ingredienti liquidi, se presenti, e aggiungere al becher. Portare il volume finale a 1 L con acqua distillata. Misurare il pH e adattarsi alle specifiche della ricetta. Se si formula un mezzo di crescita liquido, non viene aggiunto alcun agar. Attaccare uno sterilizzatore filtrante a una pompa a vuoto e versare il mezzo di crescita liquida attraverso il filtro. Accendere la pompa e attendere che tutto il liquido venga estratto. Posizionare un tappo sul contenitore e allegare un’etichetta. Se si formula un mezzo di crescita solido, dopo aver regolato il pH, aggiungere l’agar direttamente in una bottiglia o in una fiaschetta. Versare il mezzo di crescita liquido da 1 L in un flaasso erlenmeyer da 2 L, o dividerlo in due bottiglie autoclabili da 1 L (500 mL ciascuna). Se si utilizzano due bottiglie, dividere l’agar e aggiungerlo direttamente alle bottiglie. Coprire il flacone con una copertura traspirante, come due strati di foglio di alluminio, per consentire al vapore di fuoriuscire. Se si utilizza una bottiglia, tappare liberamente il coperchio della vite sulla parte superiore. Autoclave a 121 gradi centigradi per 25 min. Dopo l’autoclaving, rimuovere il mezzo di crescita dall’autoclave e raffreddare a 55-60 gradi centigradi (un bagno d’acqua impostato a 55 gradi centigradi può rendere questo più facile). Mantenere il mezzo di crescita in uno stato liquido per alcune ore fino a quando non è conveniente versare piastre. Una volta raffreddato, aggiungere tutti gli additivi post-sterilizzazione (vedi Tabella 1) e mescolare accuratamente. Dopo aver aggiunto tutti gli ingredienti, versare il volume designato nel contenitore di scelta in un cappuccio a flusso laminare. Il mezzo di crescita può essere versato nei piatti Petri desiderati manualmente o utilizzando un apparato di erogazione liquida. Quando si versa manualmente, si consiglia di trasferire un grande volume di mezzo autoclaved in un becher sterile più piccolo (500 mL) per facilità di manipolazione. Lasciare raffreddare e solidificare il mezzo di crescita. Il mezzo di crescita sarà disponibile per l’uso una volta diventando solido ed è meglio utilizzato il giorno successivo dopo l’essiccazione leggermente durante la notte in una cappa di flusso sterile come pile di piastre lepille. Dopo l’essiccazione notturna, trasferire le piastre in maniche di plastica, piegare l’estremità libera, e tenerlo in posizione con un po ‘di nastro adesivo. Ciò impedisce un’eccessiva essiccazione. Il supporto può essere conservato in un ambiente fresco, buio e pulito (4-16 gradi centigradi) per un massimo di 1 mese. 2. Coltivare piante da donatore e raccogliere orecchie immature Coltivare qualsiasi mais pubblicamente disponibile inbred (cioè B73, Mo17 o W22) in una serra in vasi da 1,5 galloni (5,9 L) contenenti un substrato senza terreno. Utilizzare un periodo fotografico di 16/8 (giorno/notte), con temperature medie di 25,5 gradi centigradi durante il giorno e 20 gradi centigradi di notte. Le piante vengono innaffiate in base alle esigenze e fecondate con un fertilizzante a rilascio controllato (N-P-K del 15-9-12), che può essere incorporato nella miscela del terreno o aggiunto alla superficie dopo la semina. Di solito ci vogliono circa 70-90 giorni dopo la germinazione del seme per le orecchie di emergere. Man mano che emergono i germogli per le orecchie, coprili con un sacchetto di tiro per evitare che si verifichi l’impollinazione incontrollata. Circa 2-3 giorni dopo l’emersio delle sete e se il polline sarà disponibile il giorno successivo, tagliare le sete utilizzando le forbici che sono state sterilizzate nel 70% di etanolo. Tagliare le sete e sbucciare circa 2,5 cm sotto l’estremità delle foglie di buccia, dove emergono le sete. L’impollinazione può essere eseguita il giorno successivo. Assicurarsi di risterilizzare le forbici tra ogni orecchio. Una volta che le antere emergono da una nappa, coprire la nappa con un sacchetto di nappa e una graffetta non skid alla base del sacchetto intorno al gambo. La mattina dopo, piegare delicatamente la pianta e toccare la borsa per incoraggiare il polline da rilasciare. Rimuovere il sacchetto di nappa e piegare la parte superiore del sacchetto per evitare che il polline scappi. Generalmente è meglio insaccare la nappa 1 giorno prima che venga utilizzata (per evitare l’accumulo di polline morto e versare ante). Polline fresco può essere raccolto da nappe per circa 3-5 giorni. Quando le antiresse emergono dai fiori interni alla base della nappa, quella nappa probabilmente non produrrà polline vitale il giorno successivo. Utilizzare il polline della stessa pianta (selfing) o di un’altra pianta dello stesso inbred (sibbing). Rimuovere il sacchetto dell’orecchio o tagliare l’estremità del sacchetto per esporre le sete, quindi versare rapidamente il polline dal sacchetto di nappa sulle sete. Coprire immediatamente l’orecchio con la sacca di nappa e pinzare la base della borsa intorno al gambo per fissarlo. Può essere utile isolare fisicamente la pianta da piante da fiore di diversi genotipi durante l’impollinazione per aiutare a prevenire l’impollinazione incrociata. Lasciare il sacchetto di nappa sull’orecchio fino a quando l’orecchio immaturo è pronto per la raccolta. 9-12 giorni dopo l’impollinazione, le orecchie dello schermo per le dimensioni dell’embrione. Far scorrere il sacchetto di impollinazione sul gambo per esporre l’orecchio. Tirare delicatamente la buccia verso il basso per esporre i chicchi su circa un terzo a un quarto della circonferenza dell’orecchio e circa un terzo della distanza verso il basso l’orecchio. I chicchi vicini alla punta non saranno rappresentativi della dimensione media dell’embrione. Utilizzando un bisturi, tagliare il tappo di un singolo kernel che appare simile alla maggior parte degli altri kernel in termini di dimensioni e colore. Utilizzare una spatola (con un righello) per rimuovere l’embrione come descritto al punto 4.6. Misurare la lunghezza dell’embrione utilizzando un righello incorporato sulla spatola o una pinza digitale. Se l’embrione è compreso tra 1,5-2,0 mm, raccogliere l’orecchio. Se è di 1,3 mm, l’orecchio può essere pronto per la raccolta più tardi nel corso della giornata e può essere ricontrollato in circa 7-8 h. 3. Preparazione della coltura delle sospensioni dell’agrobacterium per l’infezione NOTA: il ceppo Agrobacterium LBA4404(Thy-) contenente PHP81430 (Figura 1) e PHP7153912 viene memorizzato come stock di glicerolo a -80 gradi centigradi. Questi materiali possono essere ottenuti da Corteva Agriscience attraverso un accordo di trasferimento di materiale. LBA4404(Thy-) è un ceppo auxotrofico che ha bisogno di timofina fornita nei media di crescita. L’utilità principale del ceppo agro-agroè è per scopi di biocontenimento. Ha l’ulteriore vantaggio di ridurre la crescita eccessiva dell’agro. Il ceppo agro-agro auxotrofico non cresce senza la timinea supplementare. Tuttavia, la timina può (presumibilmente) essere fornita dalla morte del tessuto vegetale nella coltura. Pertanto, c’è ancora la necessità di fornire un antibiotico nel mezzo per controllare completamente l’Agro auxotrofico. Tuttavia, sarà più facile da controllare a causa della crescita compromessa del ceppo auxotrofico in assenza di timidina. Quattro giorni prima della data dell’infezione, avviare una piastra “madre” dal brodo di glicerolo striando i batteri su una piastra YP con 50 mg/L di tiofina, 50 mg/L gentamicina e 50 mg/L spettronomina(tabella 1). Incubare la piastra “madre” in un’incubatrice di 20 gradi centigradi per 3 giorni. Un giorno prima dell’esperimento di infezione, preparare una piastra “di lavoro” selezionando una o cinque colonie dalla piastra “madre” e striando i batteri dalla piastra “madre” a una nuova piastra YP (con timina, gentnemica e spettronomina; Tabella 1). Streak la piastra quotidiana “di lavoro” in quadranti sequenziali ed eseguire il loop 1x attraverso l’area appena striata nel quadrante successivo, ripetendo per formare quadranti che sono stati diluiti serialmente. Incubare la piastra “di lavoro” durante la notte in un’incubatrice a 27 gradi centigradi. Dopo aver completato la dissezione dell’embrione (passaggio 4.8), utilizzare un ciclo o uno strumento simile per raccogliere l’Agrobacterium da una regione della piastra “di lavoro” in cui la crescita batterica è visibile come sottili striature di colonie.NOTA: Evitare le aree della piastra con un prato denso di crescita batterica. La crescita dell’Agrobatterio ha probabilmente già iniziato a diminuire in aree dense, mentre nelle aree con colonie visibili i batteri sono nella fase di crescita corretta per l’infezione. Sospendere i batteri raccolti in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di 700A mezzo liquido (Tabella 1). Vortex per sospendere completamente la coltura batterica. Misurare la densità ottica ad una lunghezza d’onda di 550 nm. Regolare il volume fino a quando l’OD è compreso tra 0,35-0,45, con 0,4 come valore ottimale.NOTA: se l’OD è superiore a 0,45, aggiungere più di 700A mezzo liquido. Se l’OD è inferiore a 0,35, inoculare più colonie agronella coltura delle sospensioni. 4. Dissezione, infezione e co-coltivazione dell’embrione Selezionare le orecchie adatte per gli esperimenti di trasformazione; questi dovrebbero avere un buon set di semi e avere embrioni di dimensioni variabili da 1,5-2,0 mm. Essi sono in genere raccolti tra 9-12 giorni dopo l’impollinazione. Le orecchie raccolte possono essere utilizzate fresche o conservate per 1-4 giorni a 4 gradi centigradi, anche se la qualità della risposta probabilmente si degrada progressivamente con uno stoccaggio prolungato oltre il primo giorno. Togliere le bucce e le sete. Inserire una maniglia nella base o nella parte superiore dell’orecchio. La maniglia può essere una coppia di pinze, cacciavite, ecc. Mettere le orecchie in un grande contenitore (ad esempio, becher 2 L con la maniglia verso l’alto, riempire il contenitore con soluzione di disinfezione. La soluzione di disinfezione è 1,8 L di 20% candeggina commerciale (1.65% ipoclorico di sodio) e un paio di gocce di surfactant Tween 20. Sterilizzare le orecchie all’interno di una panca a flusso laminare. Dopo 20 min, svuotare la soluzione di candeggina e sciacquare le orecchie 3x (5 min ciascuna) utilizzando una generosa quantità di acqua distillata sterile. Rimuovere l’acqua e lasciare asciugare le orecchie per alcuni minuti.NOTA: È importante che le orecchie siano completamente sommerse nella soluzione di candeggina per 20 min. Spostare le orecchie con attenzione nella soluzione di candeggina di tanto in tanto per spostare le bolle d’aria. Preparare un tubo di microcentrifuga da 2 mL riempito con un mezzo liquido 700A. Questo tubo sarà utilizzato per raccogliere gli embrioni immaturi. Prendere l’orecchio e con un bisturi sterile, rimuovere i primi 1-2 mm delle corone del kernel per esporre l’endosperma. Utilizzare una micro spatola per rimuovere l’embrione zigotico immaturo (EI). L’IE sarà situato all’interno del kernel, sul lato rivolto verso la punta dell’orecchio e vicino all’attaccamento alla pannocchia. Utilizzando la spatola, inserirla nell’endosperma nel pericarp più lontano dall’embrione, quindi ruotare delicatamente verso l’alto per spostare l’endosperma e consentire la rimozione dell’embrione (Figura 2). Utilizzando la spatola, trasferire l’embrione nel tubo contenente il mezzo liquido 700A. Continuare a fare questo fino a quando non sono stati raccolti fino a 100 embrioni. Più tubi possono essere riempiti (embrioni/tubi) di 100 dollari prima di procedere alla fase successiva. A questo punto, la sospensione Agrobacterium deve essere preparata (vedi passo 3.5). Rimuovere il mezzo liquido 700A dal tubo embrionale con una pipetta da 1 mL. Aggiungere nuovo 700A mezzo per lavare gli embrioni, quindi rimuovere anche quel supporto. Aggiungere 1 mL della sospensione Agrobacterium e del vortice su un’impostazione bassa (3/10) per 30 s o invertire il tubo 12x-15x per mescolare. Lasciare riposare questo tubo orizzontalmente sulla panchina per 5 min. Dopo 5 min, trasferire l’intero tubo di embrioni e sospensione Agrobacterium su una piastra di 562V centro di co-coltivazione (tabella 1). Questo può essere ottenuto posizionando la piastra sulla panca e versando rapidamente il contenuto del tubo sulla piastra. Ruotare delicatamente la piastra per distribuire gli embrioni e rimuovere la sospensione Agrobacterium utilizzando una pipetta da 1 mL. Assicurarsi che gli embrioni siano posizionati con il lato scutellum (rotondo) rivolto verso l’alto. Se necessario, utilizzare una lente di ingrandimento o un mirino di dissezione. Mettere le piastre in scatole di plastica (19 cm x 28 cm x 5,1 cm) e incubare le piastre durante la notte 16-18 h a 21 gradi centigradi al buio. Non è necessario avvolgere la piastra con pellicola di paraffina o nastro adesivo. Dopo la co-coltivazione notturna, spostare gli embrioni infetti, il lato del scutellum verso l’alto, sul mezzo a riposo 605T (Tabella 1). Mettere circa 30 embrioni per piastra. Incubare le piastre a 26-28 gradi centigradi al buio. Incubare per 4-10 giorni (7 giorni è preferito). In questo momento, lo sviluppo di embrioni somatici può essere osservato sulla superficie dello scutellum zigotico (Figura 3). 5. Selezione, trattamento termico e rigenerazione Dopo il periodo di riposo, il calore scuote gli embrioni. Posizionare la scatola contenente le lastre di embrioni in un’incubatrice di 45 gradi centigradi con umidità relativa del 70% per 2 h. Quindi, togliere la scatola dall’incubatrice a 45 gradi centigradi e collocarla nell’incubatrice scura 26-28 gradi per 1-2 h.NOTA: Se non è possibile raggiungere il 70% di umidità in un’incubatrice, aggiungere un doppio strato di asciugamani di carta autoclavi sul fondo della scatola della piastra e immergere con acqua autoclaved per mantenere l’umidità all’interno della scatola. Riportare i piatti sulla parte superiore degli asciugamani di carta e sigillare il coperchio prima di posizionarlo a 45 gradi centigradi. Utilizzare un piccolo igrometro/termometro digitale per monitorare la temperatura e l’umidità. Trasferire le IE trattate termicamente dal mezzo di riposo al mezzo di formazione del tiro (13329A) contenente 0,05 mg/L imazapyr come agente selettivo (tabella 1). Durante il trasferimento, rimuovere i coleoptiles, se presenti, usando pinze a punta fine o forbici chirurgiche. Mettere 10-15 embrioni per piastra per evitare il sovraffollamento. Conservare gli embrioni in questo mezzo per 2 settimane nell’incubatrice scura a 26 gradi centigradi. Trasferire gli embrioni al mezzo di radicamento (13158; Tabella 1) per 1-2 settimane. Collocare circa otto pezzi per piatto e incubare in una stanza luminosa o camera luminosa (16 giorno/8 notte, 20-150 mol/m2/s) a 27 gradi centigradi. Man mano che si sviluppano le piantagioni, posiziona le piantine più forti contenenti sia germogli che radici vigorose su nuove piastre di radicamento medie, posiziona una pianta per piastra. Ciò consentirà una maggiore crescita delle plantiche. Posizionare le piastre nella stanza luminosa o nella camera luminosa per altri 7-14 giorni.NOTA: rimuovere con attenzione tutti i pezzi callus associati alla pianta per assicurarsi che sia in buon contatto con il mezzo. Come la pianta diventa più vigorosa, rimuovere la pianta dal mezzo di radicamento e sciacquare le radici con acqua del rubinetto per rimuovere l’agar. Trapiantare singole piante in 3 penti in2 (19 cm2)contenenti un substrato soilless pre-bagnato. Mettere le pentole in un vassoio (27 cm x 54 cm) con fori di scarico e coprire l’appartamento con una cupola di umidità di plastica. Questa fase di acclimatamento può essere raggiunta sia nella camera di crescita che in serra con condizioni di crescita descritte nella sezione 2 (passaggio 2.1) sopra. 6. Trapianto alla serra e produzione di semi di T1 Controllare le piante 2 volte al giorno. Acqua in base alle esigenze. Assicurarsi che le piante non siano né essiccate né sovranviate. Mantenere un substrato leggermente asciutto favorisce la crescita della radice.NOTA: La cupola di umidità può essere rimossa 4-7 giorni dopo il trapianto. Le piante devono essere coltivate in questi piccoli vasi fino a quando non hanno visibilmente recuperato dallo stress del trapianto al suolo. Questo dovrebbe richiedere circa 9-14 giorni. Trapiantare l’intero tappo e piantalet senza terreno in un vaso da 1,5 gal (5,9 L). Mantenere in serra e acqua quando il terreno si sente asciutto al tatto. Aggiungere un fertilizzante a rilascio controllato con N-P-K di 15-9-12 al piatto, che può essere incorporato nella miscela di substrato o applicato alla superficie. Quando i germogli auricolari iniziano ad emergere dalla pianta, utilizzare una borsa di tiro per coprire i germogli dell’orecchio. Assicurarsi di utilizzare un sacchetto semi-trasparente in modo che le sete emergenti possano essere osservate senza rimozione della borsa. Il sacco di tiro consente l’impollinazione controllata. È importante bagare sempre le nappe transgeniche. Dopo che le sete emergono (1-2 giorni), tagliare le sete emerse ad una lunghezza uniforme. Questo sarà circa 2,5 cm sotto la parte superiore delle foglie di buccia. Utilizzare un paio di forbici pulite che sono state sterilizzate nel 70% di etanolo. Tagliando le sete, un ciuffo uniforme si sviluppa il giorno seguente per l’impollinazione. Per la maggior parte dei genotipi di mais, il tempo ottimale per l’impollinazione è 2-3 giorni dopo l’emergere di nappa o seta. Raccogliere il polline dalla stessa pianta (se auto-impollinato) o da un tipo selvaggio dello stesso inbred (se in corso di attraversamento o inviccolo). Raccogliere il polline in un sacchetto di nappe e applicarlo sul ciuffo di seta della pianta T0. Se il polline proviene da una pianta di tipo selvatico (non transgenica), posizionare il polline in un sacchetto di nappa marrone pianura. Se il polline proviene da una pianta transgenica, posiziona il polline in un sacchetto a strisce verdi per indicare che il polline è transgenico. Seguire i passaggi 2.5-2.10 per i dettagli sull’impollinazione. Circa 2 settimane dopo l’impollinazione, rimuovere i sacchetti di nappa dalle orecchie e lasciare asciugare per iniziare. Per asciugare, smettere di annaffiare la pianta 21-25 giorni dopo l’impollinazione. Puoi anche tirare indietro le foglie di buccia per esporre il seme. Questa pratica aiuta anche a prevenire la muffa. Circa 45 giorni dopo l’impollinazione, raccogliere i semi e conservarli in celle frigorifere a 4-12 gradi centigradi.