Detta protokoll beskriver en metod för rening av polymorfonukleära leukocyter från hela humanblod och två distinkta analyser som kvantifierar cytotoxiciteten av Staphylococcus aureus mot dessa viktiga medfödda immunceller.
Staphylococcus aureus kan utsöndrande ett brett spektrum av leukocidins att rikta och störa membranet integritet polymorfonukleära leukocyter (PMNs eller neutrofiler). Detta protokoll beskriver både rening av mänskliga PMNs och kvantifiering av S. aureus cytotoxicitet mot PMNs i tre olika sektioner. Avsnitt 1 specificerar isoleringen av PMNs och serum från humant blod med hjälp av densitetscentrifugering. Avsnitt 2 testar cytotoxiciteten av extracellulära proteiner som produceras av S. aureus mot dessa renade humana PMNs. avsnitt 3 mäter cytotoxiciteten mot humana PMNs efter fagocytos av levande S. aureus. Dessa förfaranden mäta störningar av PMN plasmamembran integritet av S. aureus leukocidins använder flödescytometri analys av PMNs behandlas med propidiumjodid jodid, en DNA-bindning fluorofore som är cellmembranet ogenomtränglig. Kollektivt, dessa metoder har fördelen av att snabbt testa S. aureus cytotoxicitet mot primära mänskliga PMNs och kan lätt anpassas för att studera andra aspekter av Host-patogen interaktioner.
Staphylococcus aureus är en grampositiv bakterie som orsakar ett brett spektrum av sjukdomar hos människor. Denna framstående patogen producerar många virulensfaktorer som bidrar till olika aspekter av infektion. Dessa inkluderar ytan molekyler som gör att S. aureus att följa olika typer av värd vävnad1, extracellulära proteiner som stör värden immunsvar2, och en matris av utsöndras toxiner som riktar sig mot olika typer av värdceller3. I denna rapport beskriver vi en metod som kvantifierar cytotoxiciteten hos extracellulära proteiner som produceras av S. aureus mot humana polymorfonukleära leukocyter (PMNs eller neutrofiler), primära effektorceller i värdens medfödda immunsvar.
PMNs är de vanligast förekommande leukocyterna hos däggdjur. Dessa cirkulerande immunceller snabbt rekryteras till platsen för värd vävnad förolämpning som svar på varningssignaler som produceras av inhemska celler eller av föreningar som är unika för invaderande mikrober. Den extracellulära ingången från dessa molekyler och från direkta kontakter med aktiverade inhemska värdceller under extravasering ökar aktiveringstillståndet för PMNs i en process som kallas priming4,5. Primed PMNs som har nått nödställda vävnad sedan utföra viktiga medfödda immunsvar som utformats för att förhindra inrättandet av infektion. Dessa inkluderar bindning och internalisering, eller fagocytos, av invaderande mikroorganismer som utlöser en kaskad av intracellulära händelser kumulera i mikrobe förstörelse av ett batteri av potenta antimikrobiella föreningar5.
PMNs spelar en viktig roll som skyddar människor från invaderande patogener och är särskilt viktiga för att förebygga S. aureus infektion4. Denna bakterie producerar dock ett brett spektrum av virulensgener som hämmar olika PMN-funktioner. Dessa inkluderar extracellulära proteiner som blockerar erkännandet av signalmolekyler, förhindra vidhäftning till värd vävnad, hämma produktionen av antimikrobiella föreningar, och kompromiss plasmamembran integritet4. S. aureus iscengör det temporala uttrycket av dessa virulensgener genom den kollektiva ingången från flera sensoriska system med två komponenter som erkänner specifika Miljösignaler. Den Saer/S två-komponent-systemet är en större upp-regulator av S. aureus virulens gen transkription underinfektion 6,7,8,9,10,11. I synnerhet har detta två-komponent-system visat sig vara avgörande för produktionen av BI-komponent leukocidins som specifikt riktar sig till Human PMNs12.
Detta protokoll är uppdelat i tre olika sektioner. I det första avsnittet beskrivs rening av PMNs från humant blod med hjälp av densitetsgradientcentrifugering med hjälp av ett protokoll som har anpassats från de metoder som fastställts av Bøyum13 och Nauseef14. Den andra och tredje avsnitt detalj två olika tekniker för att undersöka S. aureus cytotoxicitet; en berusar PMNs med extracellulära proteiner som produceras av S. aureus medan den andra undersöker förmågan hos levande bakterier att skada PMNs efter fagocytos. Dessa förfaranden använder propidiumjodid jodid att mäta förlusten av PMN plasmamembran integritet orsakad av S. aureus pore-Forming toxiner. Propidium jodid är en DNA-bindande fluorophore som normalt är cellmembranet ogenomtränglig men kan korsa plasmamembran som har störts av S. aureus toxiner. Flödescytometrianalys gör det möjligt att snabbt kvantifiera propidiumjodid iodide-positiva PMNs för att mäta den relativa cytotoxiciteten hos S. aureus -stammar. Meticillinresistenta S. aureus (MRSA) identifierats som pulsad-fält gel elektrofores typ USA300 och en ISOGEN radering Mutant av Saer/s i denna stam (USA300ΔSaer/s) har använts som modeller för att visa hur dessa förfaranden kan kvantifiera cytotoxicitet av S. aureus mot mänskliga PMNs.
Detta protokoll beskriver rening av PMNs från humant blod och två distinkta analyser som använder propidiumjodid jodid för att kvantifiera cytotoxiciteten hos S. aureus mot dessa viktiga medfödda immunceller. Framgången för dessa förfaranden kommer att bero på kvaliteten på renade PMNs och lämplig beredning av S. aureus och extracellulära proteiner som produceras av denna patogen. För isolering av PMNs, är det viktigt att minimera PMN aktivering under och efter rening genom att använda reagenser fria från endotoxin förorening, behandla cell preparat försiktigt, och hålla celler vid lämplig temperatur. Tecken som indikerar aktivering av PMNs inkluderar klumpar av celler under rening och när mer än 5% av isolerade celler fläcken positiv för propidiumjodid jodid. På grund av PMNs relativt korta livslängd måste dessa celler isoleras från mänskligt blod och testas samma dag. PMNs kommer att börja uppvisa tecken på spontan apoptos om de lämnas på is under mer än 3 h efter rening. Som tidigare nämnts, det är mycket viktigt att varje PMN beredning utvärderas noggrant med hjälp av flödescytometri analys av framåt och sida scatter samt propidiumjodid jodid färgning för att säkerställa renhet och integritet isolerade celler.
Uttrycket av BI-komponent leukocidins av S. aureus är ansvarig för majoriteten av äventyras PMN plasmamembran integritet som observeras med hjälp av analyser som beskrivs i detta protokoll. Variation i uttrycket av dessa toxiner och andra Porbildande peptider, såsom fenollösliga Moduliner, mellan stammar av S. aureus kommer att producera skillnader i cytotoxicitet mot mänskliga PMNs. signifikanta avvikelser under in vitro-tillväxt mellan S. aureus stammar kommer också att påverka uttrycket av Porbildande toxiner och efterföljande cytotoxicitet. Dessutom, förhållandet mellan S. aureus till PMNs i fagocytos analyser har en stor inverkan på efterföljande PMN plasmamembran permeabilitet (figur 3a) och dessa experiment kräver konsekvent skörd av lika koncentrationer av varje S. aureus stam testas vid mitten av exponentiell tillväxtfas med hjälp av OD600 av subodlade bakterier. Med tanke på dessa överväganden, det är mycket viktigt att definiera tillväxtkurvor för alla stammar som kommer att undersökas innan du påbörjar cytotoxicitetsanalyser. Vi rekommenderar inte dessa metoder för att analysera S. aureus cytotoxicitet med stammar som uppvisar signifikanta tillväxtskillnader in vitro.
USA300 är ett virulent MRSA-isolat som är känt för att vara mycket cytotoxiskt mot humant PMNs15 och förlusten av Saer/S i denna stam minskar dramatiskt transkription av många bi-komponent leukocidins som riktar mänskliga PMNs6,12, vilket gör dessa stammar idealiska modeller för att jämföra cytotoxicitet med hjälp av de beskrivna analyserna. Emellertid, det finns omfattande genetisk variation mellan olika s. aureus isolat och de parametrar som beskrivs i dessa protokoll kan inte resultera i betydande förändringar i cytotoxicitet mot mänskliga PMNs när man testar andra S. aureus stammar. Att skräddarsy tillväxtförhållanden, volymer av supernatanter tillsätts eller förhållandet mellan bakterier till PMNs kan krävas för framgång med dessa metoder med hjälp av andra stammar av S. aureus.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av US National Institutes of Health beviljar NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 samt medel från Montana State University Agriculture experiment Station, och en utrustning bidrag från Murdock välgörenhet Trust .
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container | Baxter | 2B1323Q | PMN purification |
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps | VWR | 89000-044 | Used in washing cells |
1.8% Sodium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | S5150 | PMN purification |
12x75mm Culture tubes | VWR | 60818-430 | Used as flow cytometry tubes |
20% (w/w) Dextran | Sigma-Aldrich | D8802 | PMN purification |
3125 Hand Tally Counter | Traceable Products | 3125CC | For counting cells |
50 mL conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | For dispensing media |
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium | FischerScientific | 211823 | For growing cell cultures |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL | FischerScientific | BD 309657 | For filtering supernatants |
Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Cell counting apparatus |
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | Used in washing cells |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | PMN purification |
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets | FischerScientific | 13-678-11E | For aspirating liquid |
Greiner CELLSTAR 96 well plates | Millipore Sigma | M0687 | Plate for holding experimental samples |
OMICRON Syringe Filters | Omicron Scientific | SFPV13R | For filtering supernatants |
Propidium iodide | ThermoFisher Scientific | P3566 | Membrane impermeable DNA stain |
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks | Cole-Parmer | EW-34503-24 | For growing cell cultures |
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red | Corning | 17-105-CV | Used in resuspending cells |
Sterile Water for Irrigation, USP | Baxter | 2F7113 | PMN purification |
The Pipette Pump | Bel-Art Products | F37898 | For aspirating liquid |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Membrane integrity positive control |