İnsan Polimorfonükleer Lökositlere Karşı Staphyloccus aureus Sitortoksitesinin Ölçülmesi

Montana State Üniversitesi İnsan Denekleri Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokol uyarınca sağlıklı bağışçılardan heparinize venöz kan toplandı. Tüm bağışçılar bu çalışmaya katılmak için yazılı izin verdi. 1. İnsan polimorfonükleer lökositlerinin saflaştırılması ve insan serumunun izolasyonu NOT: Tüm reaktifler, ticari olarak kullanılabilen endotoksin algılama kiti kullanılarak endotoksin varlığı rutin olarak kontrol edilmeli ve PMN’lerin istenmeyen astarlanmasını önlemek için <25.0 pg/mL endotoksin içermelidir. %3 dekstran-%0,9 NaCl (w/v), 35 mL %0,9 NaCl (w/v), 20 mL %1,8 NaCl (w/v), 12 mL 1,077 g/mL yoğunluk gradyan çözeltisi ve oda sıcaklığına 20 mL enjeksiyon veya sulama sınıfı su getirin. İnsan serumu izole etmek için, 37 °C’de 37 °C’de 15 mL cam tüpte 4 mL taze çekilmiş insan kanı kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika için 2.000-3.000 × g santrifüj örneği. Üst serum tabakasını taze 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerine yerleştirin. 25 mL taze çekilmiş heparinize (1000 adet/mL) tam insan kanını 25 mL oda sıcaklığında %3 dekstran-0,9% NaCl (1:1 oran) ile iki çoğaltma 50 mL konik santrifüj tüpünde (tüp başına 50 mL toplam hacim) birleştirin. Her 50 mL konik tüpü hafifçe sallayarak karıştırın ve 30 dk oda sıcaklığında bekletin. Oda sıcaklığında kuluçkadan sonra iki ayrı katman görünür. Her dextran-kan karışımının üst tabakasını yeni 50 mL konik tüplere ve santrifüje 450 x g’de 10 dakika oda sıcaklığında düşük veya frensiz olarak aktarın. Dikkatlice hem supernatants aspire ve hücre pelet rahatsız etmeden atın. Her hücre peletini 2 mL oda sıcaklığında %0,9 NaCl’de hafifçe askıya alın, resuspended peletleri tek bir 50 mL konik tüpte birleştirin, sonra kalan %0,9 NaCl’i (35 mL’lik son hacim) ekleyin. El pipeti kullanarak hücre süspansiyonunun altında 1,077 g/mL yoğunluk gradyan çözeltisi 10 mL oda sıcaklığını dikkatlice alt altında türün. Düşük veya hiç frensiz oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 450 x g’de döndürün. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant’ı hafifçe aspire edin. Supernatant daha önce açıklandığı gibi toplanabilir periferik kan mononükleer hücreleriiçerecektir 14. Oda sıcaklığında su 20 mL hücre pelet resuaskıya alarak kırmızı kan hücreleri lyse. 30 s için tüp sallayarak yavaşça karıştırın. Kırmızı kan hücrelerinin lysis bulanıklık belirgin bir azalma eşlik edecek. Hemen oda sıcaklığında 10 dakika için 450 × g de% 1.8 NaCl (oda sıcaklığında [RT]) ve santrifüj örnek 20 mL ekleyin.NOT: PMN verimini en üst düzeye çıkarmak ve PMN lysis ve/veya aktivasyonu önlemek için kırmızı kan hücreli lysis’i takiben PMN’lerin tek başına suda bırakıldığı süreyi en aza indirmek önemlidir. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant’ı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini 2 mL’lik RT RPMI 1640 orta ve buz üzerinde yavaşça yeniden askıya alın. Hemositometre kullanarak hücreleri say. 1 x 107 hücre/mL konsantrasyonda buz gibi RPMI ile saflaştırılmış PMN’leri yeniden askıya alın ve buzda tutun. 100 μL saflaştırılmış PMN’yi (1 x 106 hücre) 300 μL buz gibi dulbecco’nun fosfat tamponlu salini (DPBS) içeren 1 μL propidium iyodür lekesi içeren iki çoğaltma akış sitometri tüpünde birleştirin. Plazma membran hasarı için pozitif kontrol için, akış sitometri tüplerinden birine 40 μL %0,5 Triton X-100 çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Saflaştırılmış hücrelerin ileri saçılım, yan dağılım ve propidium iyodür boyama (535/617 nm de uyarma / emisyon maxima) ölçmek için akış sitometri kullanın(Şekil 1).NOT: İleri ve yan dağılım analizi istenmeyen lenfosit ve monosit popülasyonlarını belirleyecektir. Propidium iyodür sadece uzlaşmış plazma zarı ve propidium iyodür pozitif hücrelerin popülasyonları belirgin olan saflaştırılmış PMN’ler ile hücreleri leke olacaktır kullanılmamalıdır. Bu çalışmalarda saflaştırılmış PMN’ler sadece saflaştırılmış hücrelerin >’ini, propidium iyodür için ise %5 oranında pozitif çıktıklarında kullanıldı. DPBS ile seyreltilmiş olan 100 μL izole insan serumu ile bu tahlilde kullanılacak tek tek kuyuları kaplayarak PMN sitotoksisite tahlilleri için 96 kuyuluk bir plaka hazırlayın.NOT: Doğrudan plastik veya cam üzerine KAPAK PMNs hücrelerin aktivasyonu neden olacaktır. Sadece medya ve% 0.05 Triton X-100 alacaksınız en az bir pozitif kontrol iyi alacak en az bir negatif kontrol iyi dahil emin olun. Plakayı 37 °C’de 30 dk kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, fazla serumu çıkarmak için kaplanmış kuyuları buz gibi DPBS ile iki kez yıkayın. Herhangi bir artık DPBS kaldırmak ve buz üzerinde yer için yavaşça plaka baş aşağı dokunun. Kaplamalı her kuyuya 1 x 107 hücre/mL’de 100 μL saflaştırılmış insan PMN’sini hafifçe ekleyin (1 x 106 PMN/iyi). PMN’lerin en az 5 dakika boyunca plakayı buz üzerinde kuluçkaya yatırarak kuyulara yerleşmelerine izin verin. 2. İnsan polimorfonükleer lökositlere karşı S. aureus ekstrasellüler proteinlerin sitotoksisite töz Kültür S. aureus bir gecede triptik soya suyu (TSB) 37 °C’de bir sallayarak inkübatör kullanarak. Bu çalışmalar için, ayrı 150 mL Erlenmeyer şişelerinde 20 mL TSB, S. aureus suşlarının ABD300 veya USA300ΔsaeR/S’nin donmuş kültürleri ile aşılanmış ve 250 rpm’de sallayarak yaklaşık 14 saat büyümüştür. Subculture S. aureus taze medya ile bir gecede bakteri kültürünün 1:100 seyreltme gerçekleştirerek. Bakteriler erken sabit büyüme aşamasına ulaşana kadar 37 °C’de titreyerek kuluçkaya yatınız.NOT: Bu deneyler için, 150 mL Erlenmeyer şişelerinde 20 mL triptik soya suyu 200 μL gecelik kültürlü USA300 veya USA300ΔsaeR/S ile aşılanmış ve 37 °C’de 250 rpm’de 5 saat sallayarak inkülasyon almıştır. Bakteriler erken sabit büyüme aşamasına ulaştığında, 1 mL alt kültürlü S. aureus’u 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe ve 5000 × g’de oda sıcaklığında 5 dakika santrifüje aktarın. Santrifüjden sonra supernatant’ı 3 mL şırıngaya aktarın. Supernatants’ı 0,22 μm’lik bir filtreden geçirerek buz üzerinde yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne geçirin. Kültür S. aureusiçin kullanılan buz gibi medya ile supernatants seri seyreltme gerçekleştirin.NOT: Gösterilen deneyler için, USA300 ve USA300ΔsaeR/S’den süpernatantlar buz gibi TSB ile art arda dört adet 1/2 günlük seyreltme yapıldı. 1.15 adımdan itibaren buz üzerinde PMN’ler içeren 96 kuyulu plakanın tek tek kuyularına tek başına süpernatant numuneler veya ortam (negatif ve pozitif kontroller için) ekleyin. Bu deneyler için her kuyuya 10 μL USA300 veya USA300ΔsaeR/S supernatant numuneleri eklenmiştir. Yavaşça kaya plakası kuyularda supernatants dağıtmak ve 37 °C’de kuluçka. İstenilen zamanlarda, kuvözden plakayı çıkarın ve buza yerleştirin. Pozitif kontrol kuyusu için %0,5 Triton X-100’ün 40 μL’sini ekleyin. Plakaya bağlı tüm PMN’leri tamamen çıkarmak için numuneleri her kuyuda hafifçe inip çıkarın, ardından numuneleri 1 μL propidium iyodür içeren 300 μL buz gibi DPBS içeren buz üzerinde sitometri tüpleri akışına aktarın. Akış sitometrisi kullanarak propidium iyodür pozitif PMN’lerin oranını ölçün (Şekil 2A). DNA’ya bağlandığında propidium iyodür 535/617 nm’de uyarma/emisyon ait. 3. S. aureus sitotoksisite fagositoz sonrası insan polimorfonükleer lökositlere karşı NOT: 600 nm (OD600)optik yoğunluğu ve bakteri konsantrasyonu ile tanımlanan büyüme eğrileri bu test başlamadan önce test edilecek S. aureus suşları için ampirik olarak belirlenmelidir. Bu deneylerin başarısı, od600 alt kültürbakterileri kullanarak orta üstel büyüme aşamasında test edilen her S. aureus suşunun eşit konsantrasyonlarda tutarlı bir şekilde hasat ını gerektirir. 2.1.1 ve 2.1.2 adımlarında açıklandığı gibi S. aureus suşları ve alt kültür bakterilerinin bir gecede başlayan kültürleri. Hasat alt kültürlenmiş S. aureus 1 mL kültürlü bakterilerin 1,5 mL mikrosantrifüj tüp ve 5.000 × g oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj aktarArak orta üstel büyüme ulaşmıştır.NOT: Büyüme koşullarımız altında, USA300 ve USA300ΔsaeR/S yaklaşık 135 dk kuluçka dan sonra orta üstel büyüme aşamasına ulaşmıştır6. Supernatant’ı keserek santrifüjden sonra S. aureus’u yıkayın, DPBS’nin 1 mL’sinde peletli bakterileri yeniden sulandırın, numuneyi 30 s’ye girdaplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika 5 dakika için 5.000 × g’de santrifüj edin. Opsonize S. aureus DPBS ile seyreltilmiş % 20 insan serumu 1 mL bakteriyel pelet resuaskıya ve 15 dakika ajitasyon ile 37 °C’de kuluçka. Oda sıcaklığında 5.000 x g’de 5 dakika santrifüj opsonize edilmiş bakteriler. Yıkama S. aureus supernatant keserek santrifüj aşağıdaki, 1 mL DPBS peletli bakterileri resumize, sonra bakteri pelet tamamen ayrı artı ek bir 30 saniye kadar örnek girdap. Oda sıcaklığında 5 dakika 5 dakika için 5.000 × g centrifuge bakteri. 1 mL RPMI opsonize S. aureus suşları resuspend, bakteriyel pelet tamamen parçalanana kadar örnek girdap, ve daha sonra ek bir 30 s. buz üzerinde bakteri yerleştirin. Seyreltik opsonize S. aureus buz gibi RPMI ile istenilen konsantrasyona suşları. Girdap 30 s ve buz üzerinde yer. Triptik soya agar üzerinde bakterilerin 1:10 seri seyreltme kaplama tarafından opsonize S. aureus konsantrasyonu doğrulayın.NOT: Bu testte kullanılan bakterilerin konsantrasyonundaki farklılıklar sonraki PMN plazma membran geçirgenliği üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceğinden(Şekil 3A),test edilen her bir suş konsantrasyonunun her deney için belirlenmesi ve suşlar arasındaki eşdeğer olması çok önemlidir. 1.14 adımdan itibaren buz üzerindeki 96 kuyuluk plakadaki PMN’lere her S. aureus süzmesinden veya RPMI’den (pozitif ve negatif kontroller için) 100°L/kuyuyu yavaşça ekleyin. Yavaşça kaya plaka kuyularda S. aureus dağıtmak için. 4 °C15’te8 dk için 500 × g plakayı santrifüj ederek fagositoz senkronize edin. Santrifüjden hemen sonra 37 °C’de kuluçka plakası (T = 0). İstenilen zamanlarda, kuvözden plakayı çıkarın ve buza yerleştirin. Pozitif kontrol kuyusu için %0,5 Triton X-100’ün 40 μL’sini ekleyin. Plakaya bağlı tüm PMN’leri tamamen çıkarmak için numuneleri her kuyuda hafifçe inip çıkarın, ardından numuneleri 1 μL propidium iyodür ile 200 μL buz gibi DPBS içeren buz üzerinde sitometri tüpleri akmaya aktarın. Adım 2.9’da açıklandığı gibi akış sitometrisini kullanarak propidium iyodür boyama örneklerini analiz edin.