Denne protokollen beskriver en metode for rensing av polymorfonukleære leukocytter fra hele menneskeblod og to distinkte analyser som kvantifisere cytotoksisitet av Staphylococcus aureus mot disse viktige medfødte immunceller.
Staphylococcus aureus er i stand til å sekresjon et bredt spekter av leukocidins som mål og forstyrrer membranen integriteten til polymorfonukleære leukocytter (PMN eller nøytrofile). Denne protokollen beskriver både rensing av menneskelig PMN og kvantifisering av S. aureus cytotoksisitet mot PMN i tre forskjellige seksjoner. § 1 detaljer isolering av PMN og serum fra humant blod ved hjelp av tetthet sentrifugering. § 2 tester cytotoksisitet av ekstracellulære proteiner produsert av S. aureus mot disse renset menneskelige PMN. § 3 måler cytotoksisitet mot menneskelige PMN etter fagocytose av Live S. aureus. Disse prosedyrene måle forstyrrelse av PMN plasma membran integritet av S. aureus leukocidins bruke Flow flowcytometri analyse av PMN behandlet med propidium iodide, en DNA bindende fluoroforen som er celle membran ugjennomtrengelig. Kollektivt, disse metodene har fordelen av hurtigtesting S. aureus cytotoksisitet mot primære menneskelige PMN og kan lett tilpasses til å studere andre aspekter av Host-patogen interaksjoner.
Staphylococcus aureus er en gram-positiv bakterie som forårsaker et bredt spekter av sykdommer hos mennesker. Denne fremtredende patogen produserer mange virulens faktorer som bidrar til ulike aspekter av infeksjonen. Disse inkluderer overflate molekyler som tillater S. aureus å følge ulike typer verts vev1, ekstracellulære proteiner som forstyrrer verten immunrespons2, og en rekke utskilles giftstoffer som er rettet mot ulike typer vert celler3. I denne rapporten beskriver vi en metode som kvantifiserer cytotoksisitet av ekstracellulære proteiner produsert av S. aureus mot menneskelige polymorfonukleære leukocytter (PMN eller nøytrofile), primære Effektor celler av verten medfødt immunrespons.
PMN er de mest tallrike leukocytter i pattedyr. Disse sirkulerende immunceller er raskt rekruttert til området av verten vev fornærmelse som svar på faresignaler produsert av fastboende celler eller av forbindelser som er unike for invaderende mikrober. Den ekstracellulære innspill fra disse molekylene og fra direkte kontakter med aktiverte bosatt vert celler under Ekstravasasjon øke aktiverings tilstanden av PMN i en prosess som kalles priming4,5. Primet PMN som har nådd distressed vev deretter utføre viktige medfødte immunresponser utformet for å hindre etablering av smitte. Disse inkluderer bindende og internalisering, eller fagocytose, av invaderende mikroorganismer som utløser en kaskade av intracellulære hendelser cumulating i mikrobe ødeleggelse av et batteri av potente antimikrobielle forbindelser5.
PMN spiller en viktig rolle som beskytter mennesker fra invaderende patogener og er spesielt viktig for å forebygge S. aureus infeksjon4. Denne bakterien produserer imidlertid et bredt spekter av virulens gener som hindrer ulike PMN-funksjoner. Disse inkluderer ekstracellulære proteiner som blokkerer anerkjennelse av signalering molekyler, hindre vedheft til å være vert vev, hemme produksjon av antimikrobielle forbindelser, og kompromiss plasma membran integritet4. S. aureus appartefakter den timelige uttrykk for disse virulens gener gjennom den kollektive innspill fra flere to-komponent sensoriske systemer som gjenkjenner spesifikke miljømessige signaler. Den SaeR/S to-komponent system er en stor opp-regulator av S. aureus virulens gen transkripsjon under smitte6,7,8,9,10,11. Spesielt er dette to-komponent-systemet vist å være avgjørende for produksjon av bi-komponent leukocidins som spesifikt mål menneskelige PMN12.
Denne protokollen er delt inn i tre forskjellige seksjoner. Den første delen beskriver rensing av PMN fra humant blod ved hjelp av tetthet gradient sentrifugering ved hjelp av en protokoll som er tilpasset fra metoder etablert av Bøyum13 og Nauseef14. Den andre og tredje delen detalj to forskjellige teknikker for å undersøke S. aureus cytotoksisitet; en forgifter sjelen PMN med ekstracellulære proteiner produsert av S. aureus mens den andre undersøker evnen til levende bakterier for å skade PMN følgende fagocytose. Disse prosedyrene bruker propidium iodide for å måle tapet av PMN plasma membran integritet forårsaket av S. aureus pore-forming giftstoffer. Propidium iodide er en DNA-bindende fluoroforen som normalt er celle membran ugjennomtrengelig men kan krysse plasma membraner som har blitt forstyrret av S. aureus giftstoffer. Flow flowcytometri analyse tillater rask kvantifisering av propidium iodide-positive PMN å måle den relative cytotoksisitet av S. aureus stammer. Meticillinresistente S. aureus (MRSA) identifisert som pulserende-feltet gel ELEKTROFORESE type USA300 og en isogenic sletting mutant av saeR/S i denne belastningen (USA300ΔsaeR/s) har blitt brukt som modeller for å demonstrere hvordan disse prosedyrene kan kvantifisere cytotoksisitet av S. aureus mot menneskelig PMN.
Denne protokollen beskriver rensing av PMN fra humant blod og to distinkte analyser som bruker propidium iodide for kvantifisere den cytotoksisitet av S. aureus mot disse viktige medfødte immunceller. Suksessen til disse prosedyrene vil avhenge av kvaliteten på renset PMN og riktig utarbeidelse av S. aureus og ekstracellulære proteiner produsert av denne patogen. For isolering av PMN, er det viktig å minimere PMN aktivering under og etter rensing ved hjelp av reagenser fri for endotoksin forurensning, behandling av celle preparater forsiktig, og holde cellene i riktig temperatur. Tegn som indikerer aktivering av PMN inkluderer klumper av celler under rensing og når mer enn 5% av isolerte celler flekken positiv for propidium iodide. På grunn av den relativt korte levetiden til PMN, må disse cellene isoleres fra humant blod og testes på samme dag. PMN vil begynne å vise tegn på spontan apoptose hvis igjen på isen for mer enn 3 h etter rensing. Som nevnt tidligere, er det svært viktig at hver PMN forberedelse er nøye vurdert ved hjelp av Flow flowcytometri analyse av fremover og side scatter samt propidium iodide flekker for å sikre renhet og integritet av isolerte celler.
Uttrykket av bi-komponent leukocidins av S. aureus er ansvarlig for flertallet av kompromittert PMN plasma membran integritet som er observert ved hjelp av analysene som er beskrevet i denne protokollen. Variasjon i uttrykk for disse giftstoffene og andre pore-forming peptider, slik som fenol-løselig modulins, mellom stammer av S. aureus vil produsere forskjeller i cytotoksisitet mot menneskelig PMN. betydelige avvik under in vitro-veksten mellom S. aureus -stammer vil også påvirke uttrykk for giftstoffer som dannes pore og påfølgende cytotoksisitet. I tillegg er forholdet mellom s. aureus til PMN i fagocytose analysene har en stor innvirkning på påfølgende PMN plasma membran permeabilitet (Figur 3a) og disse eksperimentene krever konsekvent innhøsting av like konsentrasjoner av hver S. aureus- stamme testet i MIDTEN av eksponentiell vekstfase ved hjelp av OD600 av subcultured bakterier. Gitt disse hensyn, er det svært viktig å definere vekst kurver for alle stammer som vil bli undersøkt før du begynner cytotoksisitet analyser. Vi anbefaler ikke disse metodene for å analysere S. aureus cytotoksisitet med stammer som viser betydelige vekst forskjeller in vitro.
USA300 er en ondartet MRSA isolat som er kjent for å være svært cytotoksisk mot menneskelige PMN15 og tap av SaeR/S i denne belastningen dramatisk reduserer transkripsjon av mange bi-komponent leukocidins som mål menneskelige PMN6,12, noe som gjør disse belastninger ideelle modeller for å sammenligne cytotoksisitet bruker analysene beskrevet. Det er imidlertid omfattende genetisk variasjon mellom ulike s. aureus isolerer og parametrene beskrevet i disse protokollene kan ikke føre til vesentlige endringer i cytotoksisitet mot menneskelige PMN når testing andre S. aureus stammer. Skreddersy vekstforhold, volumer av supernatanter lagt til, eller forholdet mellom bakterier til PMN kan være nødvendig for å lykkes med disse metodene ved hjelp av andre stammer av S. aureus.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health Grants NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 samt midler fra Montana State University landbruk Experiment Station, og et utstyr stipend fra Murdock veldedige Trust .
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container | Baxter | 2B1323Q | PMN purification |
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps | VWR | 89000-044 | Used in washing cells |
1.8% Sodium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | S5150 | PMN purification |
12x75mm Culture tubes | VWR | 60818-430 | Used as flow cytometry tubes |
20% (w/w) Dextran | Sigma-Aldrich | D8802 | PMN purification |
3125 Hand Tally Counter | Traceable Products | 3125CC | For counting cells |
50 mL conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | For dispensing media |
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium | FischerScientific | 211823 | For growing cell cultures |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL | FischerScientific | BD 309657 | For filtering supernatants |
Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Cell counting apparatus |
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | Used in washing cells |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | PMN purification |
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets | FischerScientific | 13-678-11E | For aspirating liquid |
Greiner CELLSTAR 96 well plates | Millipore Sigma | M0687 | Plate for holding experimental samples |
OMICRON Syringe Filters | Omicron Scientific | SFPV13R | For filtering supernatants |
Propidium iodide | ThermoFisher Scientific | P3566 | Membrane impermeable DNA stain |
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks | Cole-Parmer | EW-34503-24 | For growing cell cultures |
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red | Corning | 17-105-CV | Used in resuspending cells |
Sterile Water for Irrigation, USP | Baxter | 2F7113 | PMN purification |
The Pipette Pump | Bel-Art Products | F37898 | For aspirating liquid |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Membrane integrity positive control |