Analyse von mitochondrialem Transport und Morphologie bei humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen bei erblicher spastischer Paraplegie
Summary
Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie sind an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das vorgestellte Protokoll verwendet induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Vorhirn-Neuronen, um mitochondrialen Transport und Morphologie bei erblicher spastischer Paraplegie zu bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des mitochondrialen Handels entlang von Axonen und die Analyse ihrer Morphologie, die das Studium neurodegenerativer Erkrankungen erleichtern wird.
Abstract
Neuronen haben intensive Anforderungen an hohe Energie, um ihre Funktionen zu unterstützen. Beeinträchtigter mitochondrialer Transport entlang von Axonen wurde bei menschlichen Neuronen beobachtet, die zur Neurodegeneration in verschiedenen Krankheitszuständen beitragen können. Obwohl es schwierig ist, die mitochondriale Dynamik in lebenden menschlichen Nerven zu untersuchen, sind solche Paradigmen entscheidend für die Untersuchung der Rolle von Mitochondrien bei der Neurodegeneration. Beschrieben hier ist ein Protokoll zur Analyse des mitochondrialen Transports und der mitochondrialen Morphologie in Vorhirn-Neuronaxonen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleitet wurden. Die iPSCs werden mit etablierten Methoden in telencephalische Glutamatergen-Neuronen unterschieden. Mitochondrien der Neuronen werden mit MitoTracker CMXRos gefärbt, und die mitochondriale Bewegung innerhalb der Axone wird mit einem Live-Zell-Bildgebungsmikroskop erfasst, das mit einem Inkubator für die Zellkultur ausgestattet ist. Zeitrafferbilder werden mit Software mit den Plugins “MultiKymograph”, “Bioformat importer” und “Macros” analysiert. Kymographen des mitochondrialen Transports werden erzeugt, und die durchschnittliche mitochondriale Geschwindigkeit in anterograde und retrograde Richtungen wird aus dem Kymographen gelesen. In Bezug auf die mitochondriale Morphologieanalyse werden mit der Bildj die mitochondriale Länge, Fläche und das Seitenverhältnis ermittelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Charakterisierung des mitochondrialen Handels entlang von Axonen und die Analyse ihrer Morphologie ermöglicht, um Studien zu neurodegenerativen Erkrankungen zu erleichtern.
Introduction
Mitochondriale Beweglichkeit und Verteilung spielen eine entscheidende Rolle bei der Erfüllung variabler und spezialisierter energetischer Anforderungen in polarisierten Neuronen. Neuronen können extrem lange Axone verlängern, um sich durch die Bildung von Synapsen mit Zielen zu verbinden, die ein hohes Maß an Energie für Ca2+-Puffer- und Ionenströme erfordern. Der Transport von Mitochondrien von Soma zu Axon ist entscheidend für die Unterstützung der axonalen und synaptischen Funktion von Neuronen. Die räumlich und zeitlich dynamische mitochondriale Bewegung wird durch schnellen axonalen Transport mit Geschwindigkeiten von mehreren Mikrometern pro Sekunde1durchgeführt.
Insbesondere nehmen Motor- oder Adapterproteine wie Kinesin und Dynein am schnellen Organellentransport entlang von Mikrotubuli teil, um die Bewegung von Mitochondrien2,3zu steuern. Normale neuronale Aktivität erfordert einen ordnungsgemäßen Transport von neu zusammengesetzten Mitochondrien vom neuronalen Soma zum distalen Axon (anterograde axonaler Transport) und umgekehrten Transport von Mitochondrien vom distalen Axon zurück zum Zellkörper (retrograde Transport). Jüngste Studien haben gezeigt, dass unsachgemäße mitochondriale Zuordnung stark mit neuronalen Defekten und motorischen neuronen degenerativen Erkrankungen4,5verbunden ist. Daher ist es wichtig, Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Bewegung entlang von Axonen in lebenden Kulturen zu etablieren, um die Rolle der Mitochondrien bei der Neurodegeneration zu sezieren.
Es gibt zwei Hauptherausforderungen bei der Untersuchung und Analyse der Verfolgung von Mitochondrien: (1) Identifizierung von Mitochondrien aus dem Hintergrund in jedem Frame und (2) Analyse und Generierung der Verbindungen zwischen jedem Frame. Bei der Lösung der ersten Herausforderung wird ein Fluoreszenz-Etikettierungsansatz häufig verwendet, um Mitochondrien vom Hintergrund zu unterscheiden, wie MitoTracker-Farbstoff oder Transfektion von fluoreszenzgebundenem mitochondrialem Targeting-Protein (z. B. Mito-GFP)6,7,8. Um die Zuordnung zwischen Frames zu analysieren, wurden in früheren Studien9mehrere Algorithmen und Softwaretools beschrieben. In einem kürzlich erschienenen Papier verglichen die Forscher vier verschiedene automatisierte Werkzeuge (z. B. Volocity, Imaris, wrMTrck und Difference Tracker), um den mitochondrialen Transport zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigten, dass trotz Diskrepanzen in Gleislänge, mitochondrialer Verdrängung, Bewegungsdauer und Geschwindigkeit diese automatisierten Werkzeuge für die Bewertung der Transportdifferenz nach behandlung10geeignet sind. Zusätzlich zu diesen Tools wurde ein integriertes Plugin “Macros” für ImageJ (geschrieben von Rietdorf und Seitz) weit verbreitet für die Analyse des mitochondrialen Transports11verwendet. Diese Methode erzeugt Kymographen, die verwendet werden können, um mitochondriale Bewegungen zu analysieren, einschließlich der Geschwindigkeit sowohl in anterograde als auch in retrograde Richtungen.
Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die sich ständig in Anzahl und Morphologie als Reaktion auf physiologische und pathologische Bedingungen verändern. Mitochondriale Spaltspaltung und Fusion regulieren die mitochondriale Morphologie und Homöostase streng. Das Ungleichgewicht zwischen mitochondrialer Spaltspaltung und Fusion kann extrem kurze oder lange mitochondriale Netzwerke induzieren, die die mitochondriale Funktion beeinträchtigen und zu abnormalen neuronalen Aktivitäten und Neurodegeneration führen können. Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie sind an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt, wie Alzheimer, Parkinson, Huntington und erbliche spastische Paraplegie (HSP)12,13,14,15. HSP ist eine heterogene Gruppe von vererbten neurologischen Erkrankungen, die durch die Degeneration des Kortikospinaltraktes und das anschließende Versagen bei der Kontrolle der unteren Gliedmaßenmuskulatur16,17gekennzeichnet sind. In dieser Studie werden iPSC-abgeleitete Vorhirn-Neuronen verwendet, um mitochondrialen Transport und Morphologie in HSP zu bewerten. Diese Methode bietet ein einzigartiges Paradigma für die Untersuchung der mitochondrialen Dynamik neuronaler Axone in lebenden Kulturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Analyse des mitochondrialen Transports und der Morphologie in neuronalen Axonen mit rotem Fluoreszenzfarbstoff und ImageJ-Software, die beide eine einzigartige Plattform zur Untersuchung der axonalen Degeneration und der mitochondrialen Morphologie bei neurodegenerativen Erkrankungen bieten. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll, einschließlich der Färbung von Mitochondrien, Live-Zell-Bildgebung, und die Analyse der Bilder. Bei dieser Methode wurde ein fluoreszierende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Spastic Paraplegia Foundation, der Blazer Foundation und der NIH (R21NS109837) unterstützt.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
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