Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária
Summary
Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.
Abstract
Os neurônios têm intensas demandas por alta energia para apoiar suas funções. O transporte mitocondrial prejudicado ao longo de axônons tem sido observado em neurônios humanos, o que pode contribuir para a neurodegeneração em vários estados da doença. Embora seja desafiador examinar a dinâmica mitocondrial nos nervos humanos vivos, tais paradigmas são fundamentais para estudar o papel das mitocôndrias na neurodegeneração. Descrito aqui está um protocolo para analisar o transporte mitocondrial e a morfologia mitocondrial em axônios de neurônios cerebrais provém derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Os iPSCs são diferenciados em neurônios glutamatergicos telencefálicos usando métodos bem estabelecidos. Mitocôndrias dos neurônios estão manchadas com MitoTracker CMXRos, e o movimento mitocondrial dentro dos axônons os axônolos são capturados usando um microscópio de imagem de células ao vivo equipado com uma incubadora para a cultura celular. Imagens de lapso de tempo são analisadas usando software com plugins “MultiKymograph”, “Bioformat importer” e “Macros”. Kymographs do transporte mitocondrial são gerados, e velocidade mitocondrial média nas direções anteroras e retrógradas é lida a partir do kymograph. Em relação à análise mitocondrial de morfologia, o comprimento mitocondrial, a área e a proporção são obtidos usando o ImageJ. Em resumo, este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia para facilitar estudos de doenças neurodegenerativas.
Introduction
A motilidade mitocondrial e a distribuição desempenham um papel vital no cumprimento de demandas energéticas variáveis e especializadas em neurônios polarizados. Os neurônios podem estender axônhons extremamente longos para se conectar com metas através da formação de sinapses, que exigem altos níveis de energia para correntes ca2+ e íons. O transporte de mitocôndrias de soma para axônomon é fundamental para suportar a função axonal e sináptica dos neurônios. O movimento mitocondrial espacial e temporalmente dinâmico é conduzido pelo transporte axonal rápido a taxas de vários micrômetros por segundo1.
Especificamente, proteínas motoras ou adaptantes, como cinesesina e dynein, participam do transporte rápido de organela ao longo de microtúbulos para controlar o movimento das mitocôndrias2,3. A atividade neuronal normal requer transporte adequado de mitocôndrias recém-montadas da soma neuronal ao axôlo distal (transporte axonal anterogrado) e transporte reverso de mitocôndrias do axôlo distal de volta ao corpo celular (transporte retrógrado). Estudos recentes indicaram que a alocação mitocondrial inadequada está fortemente associada a defeitos neuronais e doenças degenerativas do neurônio motor4,5. Portanto, para dissecar o papel das mitocôndrias na neurodegeneração, é importante estabelecer métodos para examinar o movimento mitocondrial ao longo de axôlos nas culturas vivas.
Existem dois desafios principais na análise e análise do rastreamento das mitocôndrias: (1) identificar mitocôndrias do fundo em cada quadro, e (2) analisar e gerar as conexões entre cada quadro. Na resolução do primeiro desafio, uma abordagem de rotulagem de fluorescência é amplamente utilizada para distinguir mitocôndrias do fundo, como o tinante MitoTracker ou transfecção de proteína mitocondrial com fluorescência (por exemplo, mito-GFP)6,7,8. Para analisar a associação entre quadros, vários algoritmos e ferramentas de software foram descritos em estudos anteriores9. Em um artigo recente, os pesquisadores compararam quatro ferramentas automatizadas diferentes (por exemplo, Volocity, Imaris, wrMTrck e Difference Tracker) para quantificar o transporte mitocondrial. Os resultados mostraram que, apesar das discrepâncias no comprimento da pista, do deslocamento mitocondrial, da duração do movimento e da velocidade, essas ferramentas automatizadas são adequadas para avaliar a diferença de transporte após o tratamento10. Além dessas ferramentas, um plugin integrado “Macros” para ImageJ (escrito por Rietdorf e Seitz) tem sido amplamente utilizado para analisar o transporte mitocondrial11. Este método gera kymogramas que podem ser usados para analisar o movimento mitocondrial, incluindo velocidade em direções anteroras e retrógradas.
Mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas que mudam constantemente de número e morfologia em resposta a condições fisiológicas e patológicas. Fissão mitocondrial e fusão regulam firmemente a morfologia mitocondrial e a homeostase. O desequilíbrio entre fissão mitocondrial e fusão pode induzir redes mitocondriais extremamente curtas ou longas, que podem prejudicar a função mitocondrial e resultar em atividades neuronais anormais e neurodegeneração. Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e paraplegia espástica hereditária (HSP)12,13,14,15. HSP é um grupo heterogêneo de distúrbios neurológicos herdados caracterizados pela degeneração do trato corticorrâmdia e subsequente falha no controle dos músculos dos membros inferiores16,17. Neste estudo, neurônios cerebrais derivados do IPSC são usados para avaliar transporte mitocondrial e morfologia em HSP. Este método fornece um paradigma único para examinar a dinâmica mitocondrial de axônsão neuronal em culturas vivas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve um método para analisar o transporte mitocondrial e a morfologia em axônios neuronais usando corante fluorescente vermelho e software ImageJ, ambos fornecem uma plataforma única para estudar degeneração axonal e morfologia mitocondrial em doenças neurodegenerativas. Existem vários passos críticos no protocolo, incluindo a coloração de mitocôndrias, imagens de células ao vivo e análise das imagens. Neste método, um corante fluorescente foi usado para manchar mitocôndrias. Uma vez que os…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Paraplegia Spastic, fundação Blazer e o NIH (R21NS109837).
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
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