Analisi del trasporto mitocondriale e della morfologia nei neuroni derivati dalle cellule staminali indotte dall'uomo in paraplegia ereditaria
Summary
Il trasporto mitocondriale alterato e la morfologia sono coinvolti in varie malattie neurodegenerative. Il protocollo presentato utilizza neuroni del prosencefalo derivati da cellule staminali pluripotenti indotte per valutare il trasporto mitocondriale e la morfologia nella paraplegia spastica ereditaria. Questo protocollo consente la caratterizzazione del traffico mitocondriale lungo gli assoni e l’analisi della loro morfologia, che faciliterà lo studio delle malattie neurodegenerative.
Abstract
I neuroni hanno richieste intense di alta energia al fine di sostenere le loro funzioni. Trasporto mitocondriale alterato lungo gli assoni è stato osservato nei neuroni umani, che possono contribuire alla neurodegenerazione in vari stati di malattia. Anche se è difficile esaminare le dinamiche mitocondriali nei nervi umani vivi, tali paradigmi sono fondamentali per studiare il ruolo dei mitocondri nella neurodegenerazione. Descritto qui è un protocollo per l’analisi del trasporto mitocondriale e della morfologia mitocondriale negli assoni neuronali del prosencefalo derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Gli iPSC sono differenziati in neuroni glutamatergici telencefali utilizzando metodi consolidati. I mitocondri dei neuroni sono macchiati con MitoTracker CMXRos, e il movimento mitocondriale all’interno degli assoni viene catturato utilizzando un microscopio di imaging a cellule vive dotato di un’incubatrice per la coltura cellulare. Le immagini time-lapse vengono analizzate utilizzando un software con plugin “MultiKymograph”, “Bioformat importer” e “Macros”. Kymographs di trasporto mitocondriale sono generati, e la velocità mitocondriale media nelle direzioni anterograde e retrogrado è letto dal kymografo. Per quanto riguarda l’analisi morfologia mitocondriale, lunghezza mitocondriale, area, e proporzioni sono ottenuti utilizzando l’ImmagineJ. In sintesi, questo protocollo consente la caratterizzazione del traffico mitocondriale lungo gli assoni e l’analisi della loro morfologia per facilitare gli studi sulle malattie neurodegenerative.
Introduction
La motilità e la distribuzione mitocondriali svolgono un ruolo vitale nel soddisfare le richieste energetiche variabili e specializzate nei neuroni polarizzati. I neuroni possono estendere gli assoni estremamente lunghi per connettersi con gli obiettivi attraverso la formazione di sinapsi, che richiedono alti livelli di energia per il buffering di Ca2 o più. Il trasporto di mitocondri da soma ad assone è fondamentale per supportare la funzione assonale e sinaptica dei neuroni. Il movimento mitocondriale a livello spaziale e temporale è condotto dal trasporto assonale veloce a velocità di diversi micrometri al secondo1.
In particolare, le proteine motorie o adattatori, come la cinesina e la dineina, partecipano al trasporto rapido di orgelli lungo i microtubuli per controllare il movimento dei mitocondri2,3. L’attività neuronale normale richiede un corretto trasporto dei mitocondri appena assemblati dal soma neuronale all’assone distale (trasporto assonale anterogrado) e il trasporto inverso dei mitocondri dall’assone distale al corpo cellulare (trasporto retrogrado). Recenti studi hanno indicato che l’allocazione mitocondriale impropria è fortemente associata a difetti neuronali e malattie degenerative del motoneurone4,5. Pertanto, per sezionare il ruolo dei mitocondri nella neurodegenerazione, è importante stabilire metodi per esaminare il movimento mitocondriale lungo gli assoni nelle culture vive.
Ci sono due sfide principali nell’esaminare e analizzare il tracciamento dei mitocondri: (1) identificare i mitocondri dallo sfondo in ogni fotogramma e (2) analizzare e generare le connessioni tra ogni fotogramma. Nel risolvere la prima sfida, un approccio di etichettatura a fluorescenza è ampiamente usato per distinguere i mitocondri dallo sfondo, come la tintura MitoTracker o la trasfezione di proteine bersaglio mitocondriali fusa di fluorescenza (ad esempio, mito-GFP)6,7,8. Per analizzare l’associazione tra i frame, diversi algoritmi e strumenti software sono stati descritti negli studi precedenti9. In un recente articolo, i ricercatori hanno confrontato quattro diversi strumenti automatizzati (ad esempio, Volocity, Imaris, wrMTrck e Difference Tracker) per quantificare il trasporto mitocondriale. I risultati hanno mostrato che, nonostante le discrepanze nella lunghezza della pista, nello spostamento mitocondriale, nella durata del movimento e nella velocità, questi strumenti automatizzati sono adatti per valutare la differenza di trasporto dopo il trattamento10. Oltre a questi strumenti, un plugin integrato “Macros” per ImageJ (scritto da Rietdorf e Seitz) è stato ampiamente utilizzato per l’analisi del trasporto mitocondriale11. Questo metodo genera kymografi che possono essere utilizzati per analizzare il movimento mitocondriale, compresa la velocità sia in direzione anterograda che retrogrado.
I mitocondri sono organelli altamente dinamici che cambiano costantemente in numero e morfologia in risposta sia a condizioni fisiologiche che patologiche. La fissione mitocondriale e la fusione regolano strettamente la morfologia mitocondriale e l’omeostasi. Lo squilibrio tra fissione mitocondriale e fusione può indurre reti mitocondriali estremamente brevi o lunghe, che possono alterare la funzione mitocondriale e provocare attività neuronali anormali e neurodegenerazione. Il trasporto mitocondriale alterato e la morfologia sono coinvolti in varie malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la malattia di Huntington e la paraplegia spastica ereditaria (HSP)12,13,14,15. HSP è un gruppo eterogeneo di disturbi neurologici ereditari caratterizzati dalla degenerazione del tratto corticospinale e dalla conseguente incapacità di controllare i muscoli degli arti inferiori16,17. In questo studio, i neuroni del prosencefalo derivati da iPSC vengono utilizzati per valutare il trasporto mitocondriale e la morfologia nell’HSP. Questo metodo fornisce un paradigma unico per esaminare le dinamiche mitocondriali degli assoni neuronali nelle culture vive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive un metodo per analizzare il trasporto mitocondriale e la morfologia negli assoni neuronali utilizzando il tinrito fluorescente rosso e il software ImageJ, entrambi che forniscono una piattaforma unica per studiare la degenerazione assonale e la morfologia mitocondriale nella malattia neurodegenerativa. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, tra cui la colorazione dei mitocondri, l’imaging delle cellule vive e l’analisi delle immagini. In questo metodo, un coloranti fluorescente è stato…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Spastic Paraplegia, dalla Blazer Foundation e dal NIH (R21NS109837).
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O’Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin’s interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington’s disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. 화학. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
