Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie
Summary
Verminderde mitochondriale vervoer en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide voorhersenen neuronen om mitochondriale vervoer en morfologie in erfelijke spastische dwarslaesie te beoordelen. Dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk, wat de studie van neurodegeneratieve ziekte zal vergemakkelijken.
Abstract
Neuronen hebben intense eisen aan hoge energie om hun functies te ondersteunen. Verminderde mitochondriale vervoer langs axonen is waargenomen in menselijke neuronen, die kunnen bijdragen aan neurodegeneratie in verschillende ziektestaten. Hoewel het een uitdaging is om mitochondriale dynamiek in levende menselijke zenuwen te onderzoeken, zijn dergelijke paradigma’s van cruciaal belang voor het bestuderen van de rol van mitochondriën in neurodegeneratie. Hier beschreven is een protocol voor het analyseren van mitochondrial eologie en mitochondriale morfologie in voorhersenen neuron axonen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). De iPSCs worden gedifferentieerd in telencephalische glutamateren met behulp van gevestigde methoden. Mitochondriën van de neuronen zijn bevlekt met MitoTracker CMXRos, en mitochondriale beweging binnen de axonen worden vastgelegd met behulp van een live-cell imaging microscoop uitgerust met een incubator voor celcultuur. Time-lapse beelden worden geanalyseerd met behulp van software met “MultiKymograph”, “Bioformat importeur”, en “Macros” plugins. Kymografen van mitochondriaal transport worden gegenereerd, en de gemiddelde mitochondriale snelheid in de anterograde en retrograde richtingen wordt gelezen uit de kymograaf. Met betrekking tot mitochondriale morfologie analyse, mitochondriale lengte, gebied, en aspect ratio worden verkregen met behulp van de ImageJ. Samengevat, dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk om studies van neurodegeneratieve ziekten te vergemakkelijken.
Introduction
Mitochondriale beweeglijkheid en distributie spelen een cruciale rol bij het vervullen van variabele en gespecialiseerde energetische eisen in gepolariseerde neuronen. Neuronen kunnen extreem lange axonen uitbreiden om verbinding te maken met doelen door de vorming van synapsen, die hoge niveaus van energie vragen voor Ca2 + buffering en ionenstromen. Transport van mitochondriën van soma naar axon is van cruciaal belang voor de ondersteuning van axonale en synaptische functie van neuronen. Ruimtelijk en tijdelijk dynamische mitochondriale beweging wordt uitgevoerd door snel axonal transport met snelheden van enkele micrometers per seconde1.
Met name motor- of adaptoreiwitten, zoals kinesin ede en dynein, nemen deel aan het snelle organelletransport langs microtubuli om de beweging van mitochondriën2,3te controleren. Normale neuronale activiteit vereist een goed transport van nieuw geassembleerde mitochondriën van neuronaal soma tot distale axon (anterograde axonal transport) en omgekeerd transport van mitochondriën van de distale axon terug naar het cellichaam (retrograde transport). Recente studies hebben aangetoond dat onjuiste mitochondriale toewijzing sterk geassocieerd is met neuronale defecten en motorneuron degeneratieve ziekten4,5. Daarom, om de rol van mitochondriën in neurodegeneratie te ontleden, is het belangrijk om methoden vast te stellen voor het onderzoeken van mitochondriale beweging langs axonen in levende culturen.
Er zijn twee belangrijke uitdagingen bij het onderzoeken en analyseren van het volgen van mitochondriën: (1) het identificeren van mitochondriën vanaf de achtergrond in elk frame, en (2) het analyseren en genereren van de verbindingen tussen elk frame. Bij het oplossen van de eerste uitdaging wordt een fluorescentieetiketteringsbenadering op grote schaal gebruikt om mitochondriën van de achtergrond te onderscheiden, zoals MitoTracker-kleurstof of transfection van met fluorescentie gefuseerd mitochondriaal doeleiwit (bijvoorbeeld mito-GFP)6,7,8. Om de associatie tussen frames te analyseren, zijn verschillende algoritmen en softwaretools beschreven in eerdere studies9. In een recent artikel vergeleken onderzoekers vier verschillende geautomatiseerde tools (bijvoorbeeld Volocity, Imaris, wrMTrck en Difference Tracker) om mitochondriaal transport te kwantificeren. De resultaten toonden aan dat ondanks verschillen in spoorlengte, mitochondriale verplaatsing, bewegingsduur en snelheid, deze geautomatiseerde instrumenten geschikt zijn voor het evalueren van het verschil in transport na behandeling10. Naast deze tools, een geïntegreerde plugin “Macro’s” voor ImageJ (geschreven door Rietdorf en Seitz) is op grote schaal gebruikt voor het analyseren van mitochondriaal vervoer11. Deze methode genereert kymografen die kunnen worden gebruikt om mitochondriale beweging te analyseren, inclusief snelheid in zowel anterograde en retrograde richtingen.
Mitochondriën zijn zeer dynamische organellen die voortdurend veranderen in aantal en morfologie in reactie op zowel fysiologische als pathologische aandoeningen. Mitochondriale splitsing en fusie regelen de mitochondriale morfologie en homeostase strak. De onbalans tussen mitochondriale splitsing en fusie kan leiden tot extreem korte of lange mitochondriale netwerken, die de mitochondriale functie kunnen schaden en kunnen resulteren in abnormale neuronale activiteiten en neurodegeneratie. Verminderde mitochondriale transport en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington, en erfelijke spastische dwarslaesie (HSP)12,13,14,15. HSP is een heterogene groep van erfelijke neurologische aandoeningen gekenmerkt door de degeneratie van het corticospinale kanaal en het daaropvolgende falen om de onderste ledematen spieren te controleren16,17. In deze studie worden iPSC-afgeleide voorhersenenneuronen gebruikt om mitochondriaal transport en morfologie in HSP te beoordelen. Deze methode biedt een uniek paradigma voor het onderzoeken van mitochondriale dynamiek van neuronale axonen in levende culturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft een methode om mitochondrial eerherstel en morfologie in neuronale axonen te analyseren met behulp van rode fluorescerende kleurstof en ImageJ-software, die beide een uniek platform bieden om axonale degeneratie en mitochondriale morfologie bij neurodegeneratieve ziekten te bestuderen. Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol, waaronder vlekken van mitochondriën, live celbeeldvorming en het analyseren van de beelden. In deze methode werd een fluorescerende kleurstof gebruikt om mitoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Spastic Paraplegia Foundation, de Blazer Foundation en de NIH (R21NS109837).
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O’Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin’s interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington’s disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. 화학. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
