Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen

In het afgelopen decennium zijn talrijke studies gericht op de nieuw geïdentificeerde CD4⁺ T-celsubset, Tfh-celsubset, voor zijn essentiële rollen in de ontwikkeling van het kiemcentrum (GC) B. B-cellymfoom 6 (Bcl6), dat voornamelijk wordt beschouwd als een genrepressor, is de afstammingsbepalende factor van Tfh-cellen voor het bewijs dat ectopische expressie van Bcl6 voldoende is om Tfh-differentiatie aan te drijven, terwijl een tekort aan Bcl6 resulteert in verdwenen Tfh-differentiatie^1,2,3. In tegenstelling tot andere CD4⁺ T helper subsets die hun effectorfunctie uitvoeren door migratie naar de plaatsen van ontsteking, bieden Tfh-cellen de B-cel vooral hulp in de B-cel folliculaire zone van milt en lymfeklier. Co-stimulatory moleculen ICOS en CD40L, spelen een belangrijke rol in de interactie tussen Tfh en GC B cellen. Tijdens Tfh-differentiatie verzendt ICOS de nodige signalen van cognate B-cellen en fungeert het ook als een receptor die migratiesignalen ontvangt van omstander B-cellen voor B-celzonelokalisatie^4,5. CD40L is een bemiddelaar van signalen van Tfh-cellen voor de proliferatie en overleving van B-cellen⁶. Een andere factor die dezelfde rol speelt als CD40L is de cytokine IL21, die voornamelijk wordt uitgescheiden door Tfh-cellen. IL21 reguleert rechtstreeks de ontwikkeling en productie van GC B-cellen van antilichamen met een hoge affiniteit, maar de rol ervan in Tfh-differentiatie is nog steeds controversieel^7,8. PD-1 en CXCR5, die nu het meest worden gebruikt bij het identificeren van Tfh-cellen in flowcytometrie-analyse, spelen ook een belangrijke rol in de differentiatie en functie van deze subset. CXCR5 is de receptor van B-cel folliculaire chemokine en bemiddelt de lokalisatie van Tfh-cellen in B-celzakjes⁹. PD-1 is nu geïdentificeerd om niet alleen de folliculaire geleidingsfunctie te hebben, maar ook kritieke signalen over te brengen tijdens het proces van GC B-cellen affiniteitsrijping¹⁰. Op basis van deze bevindingen zou het evalueren van de expressie van deze moleculen in feite de rijping en functie van Tfh-cellen kunnen weerspiegelen.

GC is een geïnduceerde voorbijgaande microanatomische structuur in secundaire lymfoïde organen en sterk afhankelijk van Tfh-cellen, waardoor het een perfecte uitlezing is om de Tfh-respons te evalueren. In GC, na het ontvangen van signalen gemedieerd door cytokines en co-stimulatory moleculen, B cellen zijn onderworpen aan klasse schakelen en somatische hypermutatie om high-affinity antilichamen te genereren¹¹. Differentiële antilichaamklasseschakeling vindt plaats in differentiële cytokine-niche, waarbij IL4 en IL21 IgG1-klasseschakeling induceren, terwijl IFNγ IgG2-klasseschakeling^{induceert 12}. Plasmacellen zijn de producenten van uitgescheiden antilichamen en zijn terminaal gedifferentieerde cellen. Net als Tfh-cellen wordt de ontwikkeling van B-cellen in GC geassocieerd met dynamische expressie van veel belangrijke moleculen. Op basis van de huidige studie kunnen GC B-cellen worden geïdentificeerd als B220⁺PNA⁺Fas⁺ of B220⁺GL7⁺Fas⁺ cellen en plasmacellen, in vergelijking met hun precursoren, downregulate expressie van B220 en upregulate CD138 expressie¹³. Bovendien kunnen beide kenmerken worden gedetecteerd in flowcytometrie en immunofluorescentieanalyse, waardoor de GC-respons op de juiste manier wordt geëvalueerd.

Robuuste cellulaire en humorale reacties worden geïnduceerd in influenzavirusinfectie, waarbij Tfh- en Th1-cellen CD4⁺ T-celrespons¹⁴domineren, waardoor het een perfect model is voor Tfh-cellen differentiatiestudie. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), een veelgebruikte muis-aangepaste stam, wordt vaak gebruikt in deze studie^14,15,16. Hier beschrijven we enkele basisprotocollen van Tfh-studierelevante test bij influenzavirusinfectie: 1) intranasale inenting van pr8-virus; 2) antigeenspecifieke Tfh-cellen, GC B- en plasmacellen en IL21-detectie met stroomcytometrie; 3) histologische visualisatie van GC; 4) detectie van antigeenspecifieke antilichaamtiter in serum met ELISA. Deze protocollen bieden de nodige technieken voor nieuwe onderzoekers in Tfh-geassocieerde studie.