الخلايا الجذعية المشتقة الفيروسية Ag محددة T الخلايا الليمفاوية قمع النسخ المتماثل HBV في الفئران
Summary
يعرض هنا بروتوكول للقمع الفعال لفيروس التهاب الكبد B (HBV) النسخ المتماثل في الفئران باستخدام نقل الخلايا بالتبني (ACT) من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية مستضد الفيروسي (Ag) محددة T الخلايا الليمفاوية. يمكن تكييف هذا الإجراء للعلاج المناعي المحتمل القائم على ACT للعدوى بفيروس التهاب الكبد V.
Abstract
عدوى فيروس التهاب الكبد B هي قضية صحية عالمية. مع إصابة أكثر من 350 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، لا تزال عدوى فيروس التهاب الكبد V السبب الرئيسي لسرطان الكبد. وهذا مصدر قلق كبير، لا سيما في البلدان النامية. فشل الجهاز المناعي في تركيب استجابة فعالة ضد فيروس التهاب الكبد V يؤدي إلى العدوى المزمنة. وعلى الرغم من وجود لقاح فيروس التهاب الكبد B ويجري إنشاء أدوية جديدة مضادة للفيروسات، فإن القضاء على خلايا خزان الفيروس لا يزال موضوعاً صحياً رئيسياً. يرد موضح هنا طريقة لتوليد مستضد فيروسي (Ag) محدد CD8+ الخلايا الليمفاوية T السامة للخلايا (CTLs) المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) (أي iPSC-CTLs)، والتي لديها القدرة على قمع النسخ المتماثل HBV. يتم إجراء النسخ المتماثل للفيروس HBV بكفاءة في الفئران من خلال الحقن الهيدرودينامي لبلازميد تعبير HBV، pAAV/HBV1.2، في الكبد. ثم، يتم نقل سطح HBV Ag-Specific الماوس iPSC-CTLs بالتبني، مما يمنع إلى حد كبير النسخ المتماثل HBV في الكبد والدم، فضلا عن يمنع HBV التعبير Ag سطح في خلايا الكبد. يوضح هذا الأسلوب النسخ المتماثل HBV في الفئران بعد الحقن الهيدرودينامي وأن الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية الفيروسية Ag-Specific CTLs يمكن منع النسخ المتماثل HBV. يوفر هذا البروتوكول طريقة مفيدة للعلاج المناعي HBV.
Introduction
بعد العدوى الحادة، يتحكم الجهاز المناعي التكيفي (أي الحصانة الفكاهية والخلوية) في الجزء الأكبر من التهاب الكبد الوبائي الحاد المرتبط بـ HBV. ومع ذلك، لا يستطيع عدد من الناس في المناطق الموبوءة بفيروس التهاب الكبد الحلقي V القضاء على الفيروسات ثم تحويلها كأفراد مزمنين. أكثر من 25٪ من المرضى المزمنين (>250 مليون شخص) في جميع أنحاء العالم تطوير مرض الكبد التدريجي، مما أدى إلى تليف الكبد و / أو سرطان الخلايا الكبدية (HCC)1. ونتيجة لذلك، لا يزال القضاء على الخلايا المصابة بإصرار يمثل مشكلة صحية عامة، على الرغم من وجود لقاح متاح2 ويجري تطوير العديد من الأدوية المضادة للفيروسات. يشمل العلاج القياسي لعدوى فيروس التهاب الكبد متعدد السنوات IFN-α، والنيوكليوزيد، ونظائرها النيوكليوتيدات. هذه العوامل لديها نشاط مضاد للفيروسات مباشرة وقدرات التحوير المناعي. ومع ذلك، يظهر التحويل المصلي لمستضد HBe (Ag)+ الناقلين مع الأجسام المضادة للحمض الهيدروكلوريك (Ab) وفقدان حمض الديوكسيريبونوكليك المصلي بشكل فردي في حوالي 20٪ من المرضى المعالجين، والسيطرة المناعية الكاملة للفيروس التحقق من الحرمان من HBsAg لا يزيد عن 5٪3. وعلاوة على ذلك، فإن الاستجابة للعلاج في كثير من الأحيان ليست دائمة. التطعيم الوقائي مع HBs Ag المؤتلف فعال للغاية في الوقاية من العدوى، ولكن التطعيم العلاجي HBs Ag غير فعال. ومن الواضح أن الاستجابات المناعية التي تتوسط فيها الخلايا T تلعب دوراً حاسماً في السيطرة على عدوى فيروس التهاب الكبد V وضعف الكبد. ومع ذلك، في مرضى التهاب الكبد المزمن، وغالبا ما يتم حذف خلايا T HBV التفاعلية، مختلة وظيفيا، أو تحويل استنفدت4،5،6. وبالتالي، في الأفراد المصابين بعدوى فيروس التهاب الكبد متعدد الكلور المستمر، لم تنجح أي محاولات لإعادة المناعة الخاصة بفيروس التهاب الكبد الفيروسي (أي الحصانة القائمة على الخلايا T) عن طريق العلاج المضاد للفيروسات، أو السيتوكينات المناعية، أو التحصين العلاجي.
نقل الخلايا بالتبني (ACT) من خلايا T Ag Ag هو علاج فعال موجهة للقضاء في نهاية المطاف على الخلايا الكبدية المتبقية wih HBV7،8. وقد تبين أن إصابة الفئران المصابة بفيروس التهاب الكبد الوبائي تسبب التهاب الكبد الوبائي العابر والمعتدل، وانخفاض كبير في نسخ حمض الريبونوكليك (RNA) في خلايا الكبد. في هذه الدراسات، لم تمنع CTLs نسخ جينات التهاب الكبد V ولكنها عززت تدهور نصوص فيروس التهاب الكبد1 9. الـ HBV CtLs مهم لمنع العدوى الفيروسية والتوسط لإزالة فيروس التهاب الكبد10و11. بالنسبة للعلاجات المستندة إلى ACT، اقترح التوسع في المختبر لخلايا T الخاصة بـ HBV مع تفاعل عال لإعادة التوطين في الجسم الحي لتكون طريقة مثالية12،13،14؛ ومع ذلك، فإن النهج الحالية مقيدة فيما يتعلق بقدراتها على توليد وفصل وزراعة الكميات والصفات المناسبة من الخلايا T الخاصة بفيروس التهاب الكبد الغذائي من المرضى للعلاجات المحتملة.
على الرغم من أن التجارب السريرية تقدم السلامة، وإمكانية التطبيق العملي، والنشاط العلاجي المحتمل للعلاجات القائمة على الخلايا عن طريق الخلايا T المهندسة التي هي محددة لخلايا الكبد المصابة بفيروس التهاب الكبد، وهناك مخاوف بشأن الآثار غير المواتية التي تحدث من استجابات المناعة الذاتية بسبب التفاعل المتبادل من مستقبلات الخلايا T الاقتران (TCR)15،16، خارج الهدف Ag الاعتراف من قبل TCR غير محددة17 وعلى الهدف خارج السمية من قبل مستقبلات Ag chimeric (CAR) 18 سنة , 19 مع الأنسجة الصحية. حاليا، الخلايا T المعدلة وراثيا، والتي لديها فقط استمرار على المدى القصير في الجسم الحي، وعادة ما تكون متوسطة أو في وقت لاحق الخلايا T. حتى الآن، الخلايا الجذعية متعددة القوى (PSCs) هي المصدر الوحيد المتاح لتوليد أعداد عالية من الخلايا T من نوع واحد Ag السذاجة20،21،22،23. يتم تحويل PSCs المستحثة (iPSCs) ببساطة من الخلايا الجسدية للمريض من خلال استخدام تحويل الجينات من عدة عوامل النسخ. ونتيجة لذلك، فإن الـ iPSCs لها خصائص مماثلة لخصائص الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)24. بسبب المرونة والإمكانية للقدرة اللانهائية على التجديد الذاتي، بالإضافة إلى استبدال الأنسجة، يمكن تطبيق العلاجات المستندة إلى iPSC على نطاق واسع في الطب التجديدي. وعلاوة على ذلك، فإن الأفواج التي تقوم عليها هذه المراكز قد تحسن إلى حد كبير العلاجات الحالية القائمة على الخلايا.
والهدف العام لهذه الطريقة هو توليد كمية كبيرة من CTLs الخاصة بفيروس التهاب الكبد متعدد الكلور من iPSCs (أي iPSC-CTLs) للعلاج المناعي القائم على ACT. المزايا على التقنيات البديلة هي أن HBV محددة iPSC-CTLs لديها TCR من نوع واحد والنمط الظاهري السذاجة، مما يؤدي إلى مزيد من الذاكرة T خلية التنمية بعد ACT. ومن الواضح أن ACT من فيروس التهاب الكبد CV محددة iPSC-CTLs يزيد من هجرة خلايا CD8+ T وظيفية في الكبد ويقلل من النسخ المتماثل HBV في كل من الكبد والدم من الفئران تدار. هذه الطريقة تكشف عن إمكانية استخدام الفيروسية Ag محددة iPSC-CTLs للعلاج المناعي HBV ويمكن تكييفها لتوليد خلايا أخرى الفيروسية Ag محددة iPSC-T للعلاج المناعي الفيروسي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم هذا البروتوكول أسلوب لإنشاء CTLs iPSC-CTLs خاص بـ Ag الفيروسية لاستخدامها كـ ACT لمنع النسخ المتماثل HBV في طراز murine. في عدوى فيروس التهاب الكبد الفيروسي المزمن، يشكل الجينوم الفيروسي كروموسوم صغير مستقر، الحمض النووي الدائري المغلق بشكل مشترك (cccDNA) الذي يمكن أن يستمر طوال عمر الخلايا الكبدية. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور آدم ج غيرينغ من معهد أبحاث مستشفى تورونتو العام على توفير الـ cDNA لـ HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)- الجينات الهجينة التي تم تقييدها من قبل الإنسان والمورين، والدكتور بي جير تشين من جامعة تايوان الوطنية لتوفيره pAAV/HBV 1.2 بناء. ويدعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منحR01AI121180، R01CA221867 و R21AI109239 إلى J. S.
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
References
- Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
- Osiowy, C. From infancy and beyond… ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
- Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
- Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
- Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
- Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).
- Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
- Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
- Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
- Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
- Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
- Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
- van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
- Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
- Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
- Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
- Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. 암 연구학. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
- Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).
- Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
- Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
- Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
- Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
- Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
- Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
- Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).
