Summary

Eine Methode zur Untersuchung der de novo Bildung von Chromatin-Domänen

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

Diese Methode wurde entwickelt, um der Bildung von PRC2-vermittelten Chromatindomänen in Zelllinien zu folgen, und die Methode kann an viele andere Systeme angepasst werden.

Abstract

Die Organisation und Struktur von Chromatindomänen ist für einzelne Zelllinien einzigartig. Ihre Fehlregulation könnte zu einem Verlust der zellulären Identität und/oder Krankheit führen. Trotz enormer Anstrengungen ist unser Verständnis der Bildung und Verbreitung von Chromatin-Domänen immer noch begrenzt. Chromatin-Domänen wurden unter stationären Bedingungen untersucht, die nicht förderlich für die Verfolgung der ersten Ereignisse während ihrer Einrichtung sind. Hier stellen wir eine Methode vor, um Chromatin-Domänen induduziert und deren Neubildung als Funktion der Zeit zu verfolgen. Obwohl, zuerst auf den Fall der PRC2-vermittelten repressiven Chromatin-Domänenbildung angewendet, könnte es leicht an andere Chromatin-Domänen angepasst werden. Die Modifikation und/oder Kombination dieser Methode mit Genomik- und Bildgebungstechnologien wird unschätzbare Werkzeuge liefern, um die Etablierung von Chromatin-Domänen im Detail zu untersuchen. Wir glauben, dass diese Methode unser Verständnis davon revolutionieren wird, wie Chromatin-Domänen sich bilden und miteinander interagieren.

Introduction

Eukaryotische Genome sind hoch gradig organisiert und Veränderungen in der Chromatin-Zugänglichkeit steuern direkt die Gentranskription1. Das Genom enthält verschiedene Arten von Chromatin-Domänen, die mit transkriptionaler Aktivität und Replikationtiming2,3korrelieren. Diese Chromatin-Domänen reichen von wenigen Kilobasen (kb) bis zu mehr als 100 kb und zeichnen sich durch eine Bereicherung in unterschiedlichen Histonmodifikationenaus 4. Die zentralen Fragen sind: Wie werden diese Domänen gebildet und wie werden sie propagiert?

Eine der am besten charakterisierten Chromatin-Domänen wird durch die Aktivität des Polycomb-Repressionskomplexes 2 (PRC2) gefördert. PRC2 ist ein Komplex mit mehreren Untereinheiten, der aus einer Teilmenge der Polycomb-Gruppe (PcG) der Proteine5,6besteht und die Mono-, Di- und Trimethylierung von Lysin 27 des Histons H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 sind mit einem repressiven Chromatinzustand verbunden, aber die Funktion von H3K27me1 ist unklar6,11. Eine der Kernkomponenten der PRC2, die embryonale Ektodermentwicklung (EED), bindet durch ihren aromatischen Käfig an das Endprodukt der PRC2-Katalyse, H3K27me3, und diese Funktion führt zur allosterischen Stimulation von PRC212,13. Die enzymatische Aktivität der VR China ist entscheidend für die Erhaltung der zellulären Identität während der Entwicklung, da die unangemessene Expression bestimmter Entwicklungsgene, die für eine bestimmte Abstammung kontraindiziert sind, schädlich wäre5,6 . Daher ist die Auflösung der Mechanismen, mit denen PRC2 die Bildung repressiver Chromatindomänen bei Säugetieren fördert, von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der zellulären Identität.

Alle bisherigen experimentellen Systeme zur Untersuchung der Chromatin-Domänenbildung einschließlich PRC2-vermittelter Chromatin-Domänen wurden unter stationären Bedingungen durchgeführt, die nicht in der Lage sind, die sich entfaltenden Ereignisse der Chromatin-Domänenbildung in Zellen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung eines induzierbaren Zellsystems vor, das die anfängliche Rekrutierung und Verbreitung von Chromatin-Domains überwacht. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Verfolgung der Bildung von PRC2-vermittelten repressiven Chromatin-Domänen, die H3K27me2/3 umfassen. Dieses System, das die mechanistischen Details der Chromatin-Domänenbildung erfassen kann, könnte angepasst werden, um andere Chromatin-Domänen zu integrieren, wie die weithin untersuchten Domänen, die entweder H2AK119ub oder H3K9me umfassen. In Kombination mit Genomik- und Bildgebungstechnologien hat dieser Ansatz das Potenzial, verschiedene, zentrale Fragen der Chromatinbiologie erfolgreich anzugehen.

Protocol

Generierung induzierbarer EED-Rettungs-MESCs 1. Zellkultur Verwenden Sie feederfreie C57BL/6-Maus-Embryonale Stammzellen (mESCs), die ein stabil integriertes CreERT2-Transgen besitzen, das sich bei Verabreichung von 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13in den Kern transortieren kann. Wachsen Sie mESCs in konventionellen ESC-Medium14,15, ergänzt mit 1000 U/mL LIF, 1 M ERK-Hemmer PD032…

Representative Results

Ein allgemeines Schema des bedingten RettungssystemsAbbildung 1 zeigt das Targeting-Schema zur bedingten Rettung von EED-KO-Zellen mit entweder WT- oder Käfigmutant (Y365A) EED, das aus dem endogenen EED-Lokus exprimiert wird. Nach dem Knocking out EED, einer Kernuntereinheit von PRC2, die für ihre Stabilität und enzymatische Aktivität unerlässlich ist, wird eine Kassette innerhalb des intron folgenden Exon s 9 von EED eingeführt (Abbildung 1</…

Discussion

Ein kraftvoller Ansatz, um die mechanistischen Details während der Bildung einer bestimmten Chromatin-Domäne zu verstehen, besteht darin, zuerst die Domäne zu stören und dann ihre Rekonstruktion in den Zellen zu verfolgen. Der Prozess kann jederzeit während der Rekonstruktion angehalten werden, um die laufenden Ereignisse im Detail zu analysieren. Frühere Studien an Chromatin-Domänen waren nicht in der Lage, solche Ereignisse zu lösen, wie sie unter stationären Bedingungen durchgeführt wurden (z. B. Vergleich v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Drs. L. Vales, D. Ozata und H. Mou für die Überarbeitung des Manuskripts. Das D.R. Lab wird vom Howard Hughes Medical Institute und den National Institutes of Health (R01CA199652 und R01NS100897) unterstützt.

Materials

(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) Sigma H7904-5MG For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) Electron Microscopy Sciences 15710 For immunofluorescence
2-mercaptoethanol LifeTechnologies 21985-023 For mESCs culture
2% Gelatin Solution Sigma G1393-100ml For mESCs culture
Accutase 500 ML Innovative Cell Tech/FISHER AT 104-500 For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson immunoresaerch 711-585-152 For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium FISHER/VWR 41799-008 For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK Fisher Sci 177445PK For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg Life Tech D1306 For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901 Stemgent 04-0006 For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein Millipore/Fisher ESG1107 For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified Atlanta S10250 For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021 Stemgent 04-0004 For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB Cell Signaling 9728S Antibody for ChIP-seq
H3K27me3 Cell Signaling 9733S Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb) Active motif 39715 Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM Invitrogen 10829-018 For mESCs culture
L-glutamine Sigma G7513 For mESCs culture
Lipofectamine 2000 LifeTech 11668019 For transfection
MangoTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21079 For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin Sigma/Roche P0781 For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T For Genotyping PCR
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit Thermo Fisher K270020 For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1 Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2 Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1 Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1 Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1 Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1 Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2 Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2 Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.

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Cite This Article
Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains. J. Vis. Exp. (150), e60039, doi:10.3791/60039 (2019).

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