コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

細胞および組織の生理学および病理学に対する物理的な力および機械的特性の影響の研究を指す分野は、メカノバイオ^ロジー1として知られている。メカノバイオロジーで利用されているいくつかの有用な技術は、単層ストレス顕微鏡と牽引力顕微鏡です。トラクション力顕微鏡は、細胞基板界面で生成されたトラクションの計算を可能にする一方、単層応力顕微鏡は、単層2内の隣接する細胞間で発生する細胞間ストレスの計算を可能にする。 ^,3,4,5,6.以前の方法から得られた結果は、細胞由来の機械的ストレスが^{細胞プロセス3、4、5}のホストの運命を決定する上で重要な役割^を果たしていることを示唆している。例えば、外部の機械的力にさらされると、集団として移動する細胞のグループは、その形態を変更し、その形状を偏光させ、加えた力の方向に沿って整列し、移動することができ、部分的には、牽引を発生^{させる7、 8}.トラクションは、細胞収縮性を評価するために使用できるメトリックを提供し、牽引力顕微鏡(TFM)を使用して計算されます。トラクション力顕微鏡(TFM)は、細胞誘発基板変形の決定から始まり、数学的に厳格な力学ベースの計算アプローチを用いて牽引場の計算を行います。トラクションを計算する能力はかなり長い間あるので、研究者はTFMを利用して、^がん9、創傷^治癒10、工学的心臓の評価を含む多くのプロセスに対するトラクションの影響を明らかにしました。ティッシュ¹¹.

TFMとMSMの実装は、次の順序で実行する必要がある3つの重要なステップに分けることができます:最初に、細胞によって生成されるヒドロゲル変形が決定されます。第二に、トラクションはヒドロゲル変形から回収されます。第三に、有限要素アプローチは、単層全体の中で正常およびせん断間のストレスを計算するために使用されます。ゲル変位を計算するために、細胞を用いた蛍光ビーズ画像を、カスタム書き込み粒子画像ベロシメトリー(PIV)ルーチンを用いて参照ビーズ画像(細胞なし)と比較した。PIV解析の交差相関ウィンドウサイズとオーバーラップは、それぞれ32 x 32ピクセルと0.5ピクセルに選択されました。このとき、ピクセルシフトを、ピクセルからミクロンへの変換係数を乗算してミクロンに変換し(顕微鏡の場合、この変換係数は0.65)、平面内変位を得た。平面外の変位を無視に関連するエラーは、ごくわずか^12,13です。ゲル変位の計算後、利用できるトラクション測定には、拘束されたトラクションと非拘束トラ^{クション8、14}の2種類があります。拘束されていないトラクションは、視野全体(セルの有無にかかわらず)のトラクションフィールドを提供し、拘束された牽引は^セル14を含む領域に対してのみ牽引フィールドを提供します。次に、細胞間ストレスは、牽引力顕微鏡の延長である単層応力顕微鏡(MSM)を用いて計算される。MSMの実装は、ニュートンの法則7で要求されているように、細胞界面で細胞間で伝達される機械的力によって、細胞の単層によって発揮される局所的な牽引力のバランスをとらなければならないという仮定に基^{づいている7 、12、13}.ここでの重要な仮定は、単層における牽引分布が知られており、力のバランスが細胞材料特性に依存しないため、セル単層を薄い弾性シートとして扱うことができるということです。もう一つの重要な仮定は、牽引力が光学視野内(単層内)内の局所細胞間応力によってバランスされ、この力バランスの影響は遠位領域(単層の^外側)13において最小限である。したがって、細胞間応力、変位、または単層境界における両方の組み合わせによって定義される境界条件は、MSM¹³を実行するために重要である。上記の情報を考慮して、MSMを使用して有限要素解析(FEM)を実行し、最大主応力(σ_max)と最小主応力(σ_分力)を回復し、単層。これらの主応力は、その後、2D平均法線間間応力[(σ_max + σ_min)/2]および2D最大せん断間応力[(σ_max – σ_min)/2]を単層全体で計算するために使用されます。^12、13.この手順については、Tambe et al.^12,13 によって詳細に説明^{されています。}

単層ストレス顕微鏡(MSM)は、単層6、7、8、12、13内で生成される細胞細胞間ストレスの計算を可能^にする。これらの細胞間ストレスは、組織の成長および修復、創傷治癒、および癌転移12、15、16、17にとって重要であることが示唆されている。また、細胞間ストレスは、内皮細胞移動および内皮バリア^機能17,18においても重要であることが示唆されている。タイトジャンクションや接着接合部などの細胞間接合部は、細胞間ストレスの生成と伝達において重要な役割を果たすることが示唆されているが、ギャップ接合部の役割は依然として不明である。ギャップ接合部は、隣接する細胞を物理的に接続し、隣接する^{細胞19、20、21}の間を通過する電流および分子(<1 KDa)の経路を提供する。内皮細胞はCx37、Cx40、およびCx43ギャップ接合^{部19、22、Cx43}を発現するが、間違いなく疾患^進行23の点で最も重要である。Cx43の重要性の証拠は、マウスにおけるCx43の遺伝的欠失が低^血圧24を生じ、血管新^生25に悪影響を及ぼすという事実で見出されうる。さらに、Cx43は、細胞の移動および増殖およびアテローム性動脈硬化症の進行において重要であることが文書化されている18、22、23、24、25.

このプロトコルでは、TFMとMSMを用いて、コンフルエント内のトラクションおよび細胞間ストレス発生が、内皮単層が内皮ギャップ接合部Cx43の破壊によって影響を受けるかどうかを調べた。我々は、2,5−ジヒドロキシカルゾン(カルコーン)でCx43を破壊し、Cx43発^現26を阻害する分子である。カルコーンは、Cx43^式26を破壊するために以前にLeeらによって報告されているように、siRNAの代わりにCx43を破壊するために使用された。また、様々な血管の予防と治療に使用できる抗炎症および抗血小板化合物であることが報告されているため、カルコンが内皮に与える影響に特に関心を持っていました。病理²⁶.カルコーン処理は実験開始の1時間後に行い、カルコーン処理単層を合計6時間画像化し、画像処理をカスタム書き込みMATLABコードで行い、トラクションを決定し、その後細胞間を決定した。応力。我々の結果は、トラクションと細胞間ストレスの全体的な減少を示し、Cx43が内皮バイオメカニクスにおいて重要な役割を果たすことを示唆した。