Summary

Оценка окислительного повреждения в первичной мыши глазной поверхностных клеток / стволовых клеток в ответ на ультрафиолет-C (UV-C) Ущерб

Published: February 15, 2020
doi:

Summary

Этот протокол демонстрирует одновременное обнаружение реактивных видов кислорода (ROS), живых клеток и мертвых клеток в живых первичных культурах из клеток поверхности мыши. 2′,7′-Dichlorofluorescececetate, пропидий йодида, и Hoechst окрашивания используются для оценки ROS, мертвых клеток, и живых клеток, соответственно, а затем изображения и анализа.

Abstract

Глазная поверхность подвергается регулярному износу из-за различных факторов окружающей среды. Воздействие УФ-С представляет опасность для здоровья работников. Здесь мы демонстрируем воздействие первичных стволовых клеток с поверхности мышки глазной поверхности на ультрафиолетовое излучение. Формирование реактивных видов кислорода (ROS) является считывателем степени окислительного стресса/повреждения. В экспериментальной обстановке in vitro также важно оценить процент мертвых клеток, генерируемых из-за окислительного стресса. В этой статье мы продемонстрируем 2′,7′-Dichlorofluorescececetate (DCFDA) окрашивание УФ-C подвергаются мыши первичных глазных стволовых клеток и их количественной оценки на основе флуоресцентных изображений DCFDA окрашивания. ОКрашивание DCFDA напрямую соответствует поколению ROS. Мы также демонстрируем количественную оценку мертвых и живых клеток путем одновременного окрашивания с пропидий йодид (PI) и Hoechst 3332 соответственно и процент DCFDA (ROS положительные) и PI положительные клетки.

Introduction

Глазная поверхность (ОС) является функциональным устройством, состоящим в основном из внешнего слоя и железистой эпителии роговицы, лахримальной железы, мейбомианской железы, конъюнктивы, части поля крышки глаза и иннервации, которые преобразовывают сигналы1. Прозрачный слой роговицы в форме купола фокусирует свет на сетчатке. Эта васкулярная ткань состоит из клеточных компонентов, таких как эпителиальные клетки, кератоциты, эндотелиальные клетки и ацеллические компоненты, такие как коллаген и гликозаминогликан2. Область осушена слезами, которые также поставляют большую часть питательных веществ. Анатомическое положение ОС заставляет ее находиться в непосредственном контакте с внешней средой, часто подвергая ее различным суровым компонентам, таким как яркий свет, микробы, частицы пыли и химические вещества. Этот фактор предрасполагает ОС к физическим травмам и делает ее подверженной различным заболеваниям.

Оксидативный стресс вызван из-за дисбаланса между производством реактивных видов кислорода (ROS) и эндогенных антиоксидантных защитных механизмов3. ROS классифицируются на реактивные молекулы и свободные радикалы, оба из которых получены из молекулярного кислорода (O2) через митохондриальную окислительную фосфорилатацию4. Первая группа состоит из нерадикальных видов, таких как перекись водорода (H2O2), синглетный кислород (1O2) и последний включает в себя такие виды, как супероксидные анионы (O2), и гидроксиловые радикалы (З.OH), среди других. Эти молекулы являются побочными продуктами нормальных клеточных процессов и их роли были вовлечены в важные физиологические функции, такие как трансдукция сигнала, экспрессия генов, и принимающей защиты5. Увеличенное производство ROS, как известно, генерируется в ответ на такие факторы, как патогенвторжения, ксенобиотики, и воздействие ультрафиолетового (УФ) излучения4. Это перепроизводство ROS приводит к окислительному стрессу, что приводит к повреждению молекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки и липиды6.

Природный солнечный свет, наиболее преобладающий источник УФ-излучения, состоит из УФ-А (400-320 нм), УФ-В (320-290 нм) и УФ-С (290-200 нм)7. Сообщалось об обратной корреляции между длиной волны и спектральными энергиями. Хотя естественные ультрафиолетовые излучения поглощаются атмосферой, искусственные источники, такие как ртутные лампы и сварочные приборы, испускают и, следовательно, представляют собой профессиональную опасность. Симптомы воздействия на глаза включают фотокератит и фотокератоконъюнктивит8. Производство ROS является одним из основных механизмов нанесения УФ индуцированного клеточного повреждения9. В текущем исследовании, мы демонстрируем обнаружение ROS с помощью 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein диацетат акцентратат (DCFDA) окрашивающий метод в мыши первичных глазных поверхностных клеток / стволовых клеток, подверженных УФ-C. Зеленая флуоресценция была захвачена с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки были противозапятнаны двумя красителем, Hoechst 33342 и красным йодидом propidium, чтобы испачкать живые и мертвые клетки, соответственно.

Protocol

Эксперимент проводился на первичных глазных клетках/стволовых клетках, полученных из швейцарского глаза мыши альбиносов. Использование животных для сбора глаз для этого эксперимента было одобрено Институциональным комитетом по этике животных, Енепоя (Считается университетом) (номер…

Representative Results

DCFDA является бесцветный краситель, который является химически уменьшенной формой флуоресцеина, используемой в качестве индикатора для обнаружения ROS в клетках. Этот краситель попадает в ловушку внутри клеток и легко окисляется до флуоресцентного дихлородигидрофторцеи (DCF), который ис?…

Discussion

Описанный здесь метод окрашивания DCFDA позволяет визуализировать ROS в первичных глазных живых клетках мыши, обработанных ультрафиолетовым излучением. Преимущество этого метода окрашивания является то, что он также позволяет исследователям изучить непосредственное воздействие УФ-С (3 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают поддержку инфраструктурных объектов исследовательского центра «Енепоя» (Университет).

Materials

2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) Sigma D6883 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm) Eppendorf SA 003700112 Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose HiMedia AT007 Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin HiMedia RM99955 One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax Gibco, Thermo Fisher Scientific 35050061 Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker UVP Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342 Sigma B2261 Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel Corning Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X) Gibco, Thermo Fisher Scientific 11140050 Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) Gibco, Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide Sigma P4170 Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express Thermo Fisher Scientific Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-rad

References

  1. Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
  2. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
  3. Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).
  4. Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
  5. Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
  6. Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. 발생학. 320 (1), 1-11 (2008).
  7. Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
  8. Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
  9. de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
  10. Degl’Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
  11. Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).

Play Video

Cite This Article
Bose, B., Kapoor, S., Sen, U., Nihad AS, M., Chaudhury, D., Shenoy P, S. Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage. J. Vis. Exp. (156), e59924, doi:10.3791/59924 (2020).

View Video