Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade
Summary
Dit protocol toont de gelijktijdige detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), levende cellen en dode cellen in levende primaire culturen van muisoculaire oppervlaktecellen. 2′,7′-Dichloorfluoresceindiacetaat, propidiumjodide en Hoechst-vlekken worden gebruikt om respectievelijk de ROS-, dode cellen en levende cellen te beoordelen, gevolgd door beeldvorming en analyse.
Abstract
Het oculaire oppervlak wordt onderworpen aan regelmatige slijtage als gevolg van verschillende omgevingsfactoren. Blootstelling aan UV-C-straling vormt een gevaar voor de gezondheid op het werk. Hier tonen we de blootstelling van primaire stamcellen van het oogoppervlak van de muis aan UV-C-straling. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) vorming is de uitlezing van de omvang van oxidatieve stress / schade. In een experimentele in vitro omgeving is het ook essentieel om het percentage dode cellen te beoordelen dat wordt gegenereerd als gevolg van oxidatieve stress. In dit artikel zullen we de 2′,7′-Dichloorfluoresceindiacetaat (DCFDA) kleuring van UV-C blootgestelde muis primaire oculaire oppervlakte stamcellen en hun kwantificering op basis van de fluorescerende beelden van DCFDA vlekken. DCFDA kleuring komt direct overeen met ros generatie. We tonen ook de kwantificering van dode en levende cellen door gelijktijdige kleuring met respectievelijk propidiumjodide (PI) en Hoechst 3332 en het percentage DCFDA (ROS-positieve) en PI-positieve cellen.
Introduction
Het oculaire oppervlak (OS) is een functionele eenheid voornamelijk samengesteld uit de buitenste laag en klierepithelia van hoornvlies, lachrymale klier, meibomian klier, bindvlies, een deel van de ooglid marges en innervations die transduce signalen1. De transparante koepelvormige hoornvlieslaag richt licht op het netvlies. Dit avasculaire weefsel bestaat uit cellulaire componenten zoals epitheelcellen, keratocyten en endotheelcellen en acellulaire componenten zoals collageen en glycosaminoglycans2. Het gebied wordt afgevoerd door tranen die ook de meeste voedingsstoffen leveren. De anatomische positie van het OS dwingt het om in direct contact met de externe omgeving te zijn, vaak bloot stellen aan verschillende harde componenten zoals fel licht, microben, stofdeeltjes en chemicaliën. Deze factor predisponeert het OS voor lichamelijkletsel en maakt het gevoelig voor verschillende ziekten.
Oxidatieve stress wordt veroorzaakt door het gebrek aan evenwicht tussen de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de endogene anti-oxidantafmechanismen3. ROS worden ingedeeld in reactieve moleculen en vrije radicalen, die beide afkomstig zijn van moleculaire zuurstof (O2) door mitochondriale oxidatieve fosforylatie4. De eerste groep bestaat uit niet-radicale soorten zoals waterstofperoxide (H2O2),singlet zuurstof (1O2) en de laatste omvat soorten zoals superoxide anionen (O2–), en hydroxyl radicalen(•OH), onder anderen. Deze moleculen zijn bijproducten van normale cellulaire processen en hun rollen zijn betrokken bij belangrijke fysiologische functies zoals signaaltransductie, genexpressie en hostdefense5. Een verbeterde productie van ROS is bekend te worden gegenereerd in reactie op factoren zoals pathogene invasie, xenobiotica, en blootstelling aan ultraviolette (UV) straling4. Deze overproductie van ROS resulteert in oxidatieve stress die leidt tot de schade van moleculen zoals nucleïnezuren, eiwitten en lipiden6.
Natuurlijk zonlicht, de meest overheersende bron van UV-straling, bestaat uit UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) en UV-C (290-200 nm)7. Een omgekeerde correlatie tussen de golflengte en spectrale energieën is gemeld. Hoewel natuurlijke UV-C-straling door de atmosfeer wordt geabsorbeerd, stoten kunstmatige bronnen zoals kwiklampen en lasinstrumenten uit en vormen daarom een beroepsrisico. Symptomen van blootstelling aan de ogen zijn fotokeratitis en photokeratoconjunctivitis8. Productie van ROS is een van de belangrijkste mechanismen van het toebrengen van UV-geïnduceerde cellulaire schade9. In de huidige studie tonen we de detectie van ROS aan met behulp van de 2′,7′-Dichloordihydrofluorescelaat (DCFDA) kleuringsmethode in de primaire oculaire oppervlaktecellen/stamcellen van de muis die zijn blootgesteld aan UV-C. De groene fluorescentie werd vastgelegd met behulp van fluorescerende microscopie. Cellen werden tegengekleurd met twee kleurstoffen, Hoechst 33342 en rode propidiumjodide, om de levende en dode cellen te bevlekken, respectievelijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
De DCFDA kleuring methode hier beschreven maakt de visualisatie van ROS in de muis primaire oculaire levende cellen behandeld met UV-C straling. Een voordeel van deze kleuringsmethode is dat het ook de onderzoekers in staat stelt om de onmiddellijke effecten van UV-C (3 uur na UVC-blootstelling) op de levende cellen en hun gelijktijdige opsomming voor het percentage ROS-positieve, evenals dode cellen te bestuderen. Bovendien, als de kleuring methode wordt gebruikt op de levende cellen, kunnen de cellen verder worden geï…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de steun van het Yenepoya Research Centre, Yenepoya (Geacht universiteit) voor de infrastructurele faciliteiten.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. 발생학. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl’Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
