Dual DNA Lineale zur Untersuchung des Mechanismus der Ribosomentranslokation mit Single-Nukleotid-Auflösung

Biomolekulare Verschiebung ist ein grundlegender Parameter bei der Untersuchung des Mechanismus der zugehörigen biologischen Funktionen. Ein besonderes Beispiel ist die Ribosomtranslokation^1,2, bei der sich das Ribosom normalerweise um genau drei Nukleotide (nt) auf der Boten-RNA (mRNA) bewegt, und um eine, zwei oder andere Nt-Zahlen außer drei im Falle von Frameshifting. Daher ist eine einstellige Auflösung des molekularen Linealsystems erforderlich, um die verschiedenen Schrittgrößen zu unterscheiden. Eine größere Herausforderung besteht darin, die Ribosombewegung sowohl auf der Ein- als auch auf der Ausgangsseite zu untersuchen. Mit anderen Worten, nur mit einem Dual-Lineal-System können wir zeigen, ob die mRNA glatt durch das Ribosom gefädelt ist, oder es gibt Zwischenschritte, in denen die beiden Seiten unterschiedliche Schrittgrößen haben, die zu einer geknickten oder geschleiften mRNA-Konformation im Inneren des Ribosom.

Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die erste Herausforderung der Lösung verschiedener Schritte auf der Austrittsseite des Ribosoms (das 3′ Ende der mRNA) zu bewältigen. Der duale Luziferase-Assay löst die verschiedenen Leserahmen auf, indem er die Verhältnisse der resultierenden verschiedenen Proteine^3,4misst. Sie gilt nur für das 3′ Ende der mRNA und reicht daher nicht aus, um ein vollständiges Bild der Translokation zu liefern. Die Massenspektrometrie kann die verschiedenen Peptidfragmente als Folge der entsprechenden Codeumlagerungen analysieren⁵. Aber es kann nicht genau bestimmen, wie viele nt das Ribosom auf der mRNA bewegt. Der Zehendruck-Assay ist eine weitere gängige Methode, die eine Reverse-Transkriptase verwendet, die am 3′-distalen Ende grundiert ist, um die mRNA in Richtung des Ribosoms⁶zu transkribieren. Es gilt jedoch nicht für das 5′ Ende von mRNA, das in das Ribosom eintritt. Andere Techniken, einschließlich Einzelmolekülansätze und Fluoreszenzmethoden⁷, sind schwierig, eine Single-nt-Auflösung zu erreichen.

Wir haben den Dual-DNA-Lineal-Assay entwickelt, der sowohl die Ein- als auch die Ausgangsposition der freigelegten mRNA in Ribosome-mRNA-Komplexen eindeutig bestimmen kann.  Die Lineal-DNAs sind DNA-Oligomere, die Duplexe einer bestimmten Anzahl von Basepairs (bp) bilden, wobei die mRNA vom Ribosom aufgedeckt wird, unabhängig davon, welches Ende der mRNA. Die bp-Zahlen zeigen dann genau die ribosomische Position auf der mRNA während der Translokation. Die bp-Nummern der Duplexe werden durch ihre kritischen Dissoziationskräfte bestimmt, die aus der kraftinduzierten Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS)⁸gewonnen werden. Bei 2-3 pN-Kraftunsicherheit reichen die kritischen Kräfte aus, um eine Single-nt-Auflösung zu bieten. Durch die Implementierung eines Linkermoleküls auf den DNA-Linealen kann die sterisch behinderte Seite der mRNA durch das Ribosom untersucht werden. So lassen sich unterschiedliche ribosomale Verschiebungen genau auflösen. Wir haben erfolgreich eine einzigartige Schleifenkonformation von mRNA aufgedeckt, die von Antibiotika während der Translokation⁹eingeschlossen wurde, und verschiedene Leserahmen aufgelöst, die auf einer rutschigen mRNA-Sequenz¹⁰koexistierten. Dieser Artikel beschreibt die Details des Dual-Lineals-Assays, zu denen die Vorbereitung der Ribosom-Komplexe, die Oberflächenfunktionalisierung der Glasgeuken, die Immobilisierung der Ribosom-Komplexe und deren Hybridisierung mit magnetisch beschrifteten DNA-Linealen gehören. Moleküle, magnetische Detektion und Kraftspektrumanalyse durch FIRMS.