Synthèse d'une norme deuterated pour la quantification de 2-Arachidonoylglycerol à Caenorhabditis elegans

Les endocannabinoïdes régulent plusieurs processus biologiques dans une variété d’organismes et sont des médiateurs lipidiques conservés¹. Les premiers endocannabinoïdes découverts et les plus bien caractérisés sont l’anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) et le glycérol 2-arachidonoyl (2-AG). Les endocannabinoïdes jouent de nombreux rôles critiques, y compris ceux impliqués dans les systèmes de récompense du cerveau ainsi que la toxicomanie, la mémoire, l’humeur, et les processus métaboliques². AEA et 2-AG ne sont synthétisés qu’en cas de besoin et ont une courte durée de vie, et ils sont dégradés par le transport de la reprise de protéines et de l’hydrolyse³.

L’utilisation de modèles animaux comme Caenorhabditis elegans (C. elegans) est devenue importante pour étudier la grande variété de processus biologiques, y compris l’apoptose, la signalisation cellulaire, le cycle cellulaire, la polarité cellulaire, la régulation des gènes, le métabolisme, le vieillissement, et la détermination du sexe^4,5. En outre, C. elegans est un excellent modèle pour étudier les rôles physiologiques des acides gras polyinsaturés (PUFA). L’AEA a été identifiée chez C. elegans et est réduite en vertu de la restriction alimentaire⁶. Cette insuffisance prolonge la durée de vie du nématode par un mécanisme diététique de restriction qui peut être supprimé par la supplémentation avec l’endocannabinoïde. Récemment, il a été découvert que 2-AG et AEA jouent un rôle fondamental dans la réglementation du trafic de cholestérol dans C. elegans⁷. Plus important encore, il a été déterminé que la supplémentation avec exogène 2-AG peut sauver l’arrestation dauer, qui est causée par le trafic de cholestérol altéré dans Niemann-Pick type C1 C. elegans mutants.

Pour mieux comprendre la relation de 2-AG avec le trafic de cholestérol et d’autres processus biologiques dans le nématode (c.-à-d. la signalisation monoaminergique, la nociception et la locomotion), il est crucial d’étudier ce métabolite endogène et comment il est affectés dans certaines conditions environnementales et diététiques^{8,9,10,11,12,13}. Par conséquent, il est impératif de concevoir et d’optimiser une méthode pour détecter et quantifier endogène 2-AG dans C. elegans qui est simple à utiliser pour les scientifiques de différents domaines, en particulier ceux qui étudient le comportement du nématode par rapport à cette endocannabinoïde.

En 2008, Lethonen et ses collègues ont réussi à identifier 2-AG et AEA dans C. elegans en utilisant les méthodes d’analyse LC-MS¹⁴. En 2011, ils ont réussi à étendre cette technique à d’autres endocannabinoïdes¹⁵. Des travaux plus récents ont montré d’autres méthodes analytiques qui ont réussi à détecter et à quantifier les endocannabinoïdes chez C. elegans, y compris la spectrométrie de masse et GC-MS^16,17,18, et il a également signalé que des méthodes analytiques similaires peuvent être étendues à d’autres modèles¹⁹.

Les méthodes analytiques précédemment signalées utilisées pour quantifier le 2-AG dans les échantillons biologiques impliquent habituellement l’utilisation de normes diluées qui sont acquises commercialement et nécessitent une disponibilité pour l’achat^20,21. De nombreuses normes analytiques pour la quantification des endocannabinoïdes LC-MS/MS sont disponibles dans le commerce auprès de différents fournisseurs. Néanmoins, ils sont chers, sont sensibles, et s’oxydent au fil du temps, en raison de la présence de multiples liaisons doubles. Les versions les plus courantes de ces normes sont basées sur l’acide arachidonique delué d’octa et conviennent à la quantification par dilution isotopique LC-MS/MS^14,22. En outre, la plupart de ces normes sont substituées dans la position 2 du glycérol, les rendant instables dans la plupart des conditions puisqu’elles sont sujettes à la migration d’acyl^19,23.

Pour surmonter les difficultés associées aux coûts et à la stabilité de ces normes deuterated, une méthode commode et simple est présentée pour préparer une norme analytique basée sur le glycérol-d₅. La séquence pour préparer la norme penta-deuterated exige une procédure en trois étapes qui a comme conséquence la norme 1-AG-d₅, qui est stable et ne subit pas la migration d’acyl (la question principale en visant à synthétiser 2-monoacylglycerols).

L’objectif principal ici est de montrer une méthode simple et reproductible pour étudier 2-AG dans C. elegans, y compris la synthèse de la norme analytique deuterated, la préparation et l’extraction des échantillons de nématode, et l’analyse par LC-MS/MS (Figure 1 ). Cette procédure synthétique est réalisable sans la connaissance sophistiquée de synthèse organique ou l’équipement spécial, le rendant approprié pour des scientifiques de différents domaines qui étudient le comportement de C. elegans sous l’influence endocannabinoïde. La méthode est également extensible à d’autres modèles d’étude, ce qui la rend utile pour différentes cibles. La norme, préparée comme indiqué ici, a été appliquée pour développer avec succès une méthode chromatographique rapide et fiable qui permet une détection efficace et la quantification de 2-AG d’une manière reproductible.