Murine modeller av åreforkalkning er nyttige verktøy for å undersøke patogene trasé på en molekylær nivå, men krever standardisert kvantifisering av lesjon utvikling. Denne protokollen beskriver en optimalisert metode for å bestemme lesjon størrelse i store arteriell fartøy, inkludert aorta roten, aorta buen, og truncus brachiocephalicus arterien.
Kardiovaskulær sykdom er den viktigste dødsårsaken i verden. Den underliggende årsaken i de fleste tilfeller er aterosklerose, som er delvis en kronisk inflammatorisk sykdom. Eksperimentell aterosklerose studier har belyst rollen som kolesterol og betennelser i sykdomsprosessen. Dette har ført til vellykkede kliniske studier med farmasøytiske agenter som reduserer kliniske manifestasjoner av aterosklerose. Forsiktig og godt kontrollerte eksperimenter i musemodeller av sykdommen kunne ytterligere belyse patogenesen av sykdommen, som ikke er fullt ut forstått. Standardisert analyse av lesjon er viktig for å redusere eksperimentell variasjon og øke reproduserbarhet. Bestemme lesjon størrelse i aorta rot, aorta bue, og truncus brachiocephalicus arterien er vanlige endepunkter i eksperimentell aterosklerose. Denne protokollen gir en teknisk beskrivelse for evaluering av aterosklerose på alle disse områdene i en enkelt mus. Protokollen er spesielt nyttig når materialet er begrenset, som ofte er tilfelle når genmodifiserte dyr blir karakterisert.
Hjerte-og karsykdommer er den viktigste dødsårsaken i verden med iskemisk hjertesykdom og hjerneslag regnskap for en i hver fire dødsfall1. De fleste tilfellene er forårsaket av aterosklerose, en sykdom preget av en langsom oppbygging av lipid-Laden plaketter med tegn på kronisk betennelse i store-og mellom store arterier2. Sykdommen er vanligvis ubemerket over flere ti år før et brudd eller erosjon av plakk utløser en arteriell trombose som fører til iskemisk vev skade.
En normal arterie består av et intima lag med endothelial celler og tynt distribuerte glatte muskelceller, et medium lag med glatte muskelceller og elastisk Lamellae, og en omkringliggende adventitial lag med løs bindevev3. En intimal oppbevaring av LDL forskyvninger aterosklerose utvikling4. Akkumulering og modifisering av lipoproteiner fører til aggregering og fast i arteriell intima5. En inflammatorisk reaksjon er fremkalt av fanget og modifisert lipoproteiner6. Endothelial celler begynner å uttrykke vedheft molekyler, for eksempel VCAM-1 på områder i arteriell treet med turbulent blodstrøm, fører til rekruttering av sirkulerende monocytter og andre leukocytter7. Den infiltrere monocytter differensiere til makrofager som sluker lipid med påfølgende transformasjon til macrophage skumceller8.
Åreforkalkning har blitt studert i mus modeller med økende frekvens siden midten av 1980-tallet. C57BL/6 er den mest brukte innavlet musen belastning for disse studiene, og det er brukt som genetisk bakgrunn for flertallet av genetisk modifiserte stammer9. Denne stammen ble etablert i 1920-tallet10, og dens Genova ble utgitt i 200211. Eksperimenter i musemodeller har flere fordeler: koloniene reproduserer raskt, boliger er plassbesparende, og innavl reduserer eksperimentell variasjon. Modellen gir også mulighet for genetisk manipulasjoner, slik som målrettede gen slettinger og innsetting av transgenes. Dette har ført til ny patofysiologiske forståelse av sykdommen og nye behandlingsmål12.
Wild-type C57BL/6 mus er naturlig motstandsdyktig mot aterosklerose. De har det meste av sirkulerende kolesterol i HDL, og komplekse aterosklerotiske lesjoner er ikke dannet selv når matet en høy-fett og høy-kolesterol diett13. Hypercholesterolemic mus, for eksempel Apoe-/- på C57BL/6-bakgrunn, blir derfor brukt som eksperimentelle modeller av aterosklerose14,15. Mangelen på ApoE svekker hepatic opptak av rest lipoproteiner og alvorlig perturbs lipid metabolisme. I Apoe-/- mus, sirkulerende kolesterol er overveiende i VLDL partikler, og musene utvikle komplekse aterosklerotiske plaketter på en vanlig Chow diett.
Ldlr-/- mus etterligne utviklingen av aterosklerose sett hos mennesker med familiær hyperkolesterolemi16. Den Ldlr-/- mus trenger en vestlig type Diet å utvikle aterosklerose17. Vestlig kosthold etterligner menneskelig matinntak og vanligvis inneholder 0,15% kolesterol. LDL-reseptoren gjenkjenner ApoB100 og ApoE og formidler opptak av LDL-partikler gjennom endocytose. LDL-reseptorer er grunnleggende for leveren clearance av LDL fra sirkulasjon, mens LDL reseptor uttrykk i blodkreft celler påvirker ikke denne prosessen. Dette åpner muligheten for benmarg transplantasjon av Ldlr+/+ celler til hypercholesterolemic Ldlr-/- mottakere og vurdering av aterosklerose utvikling. Benmarg chimeras har ofte blitt brukt til å studere deltakelse av blodkreft celler i eksperimentell aterosklerose. Men, benmarg transplantasjon kan påvirke størrelsen og sammensetningen av aterosklerotiske plaketter, noe som gjør tolkning av resultatene tvetydig.
Ulike varianter av Apoe-/- og Ldlr-/- mus med flere genetiske endringer er utviklet for å studere spesifikke prosesser av sykdommen18. Et eksempel er humant APOB100-transgene Ldlr-/- (HuBL) mus som bærer full-length humant APOB100 gen19,20. Disse musene utvikle hyperkolesterolemi og aterosklerose på en vanlig Chow diett. Imidlertid tar utviklingen av komplekse aterosklerotiske plaketter minst seks måneder og kortere eksperimentelle protokoller vanligvis bruker vestlig kosthold21. En stor brøkdel av plasma kolesterol sirkulerer i LDL partikler, noe som gir HuBL mus en mer menneskelig-lignende dyslipidemic lipoprotein profil i forhold til Apoe-/- og Ldlr-/- mus. HuBL mus også tillate studier av menneskelig apoB som en autoantigen22.
Musen modeller av aterosklerose utvikle komplekse aterosklerotiske plaketter med fellestrekk ved menneskelig sykdom. Men plakk er ganske motstandsdyktig mot brudd med påfølgende hjerteinfarkt. Atherothrombosis er bare sporadisk oppdaget og eksperimentelt utfordrende å vurdere23,24,25. Spesielle modeller av plakk brudd har blitt utviklet, men det eksperimentelle feltet mangler en pålitelig og reproduserbar modell for vurdering av plakk stabiliserende agenter.
Kvantifisering av aterosklerose har blitt rapportert på mange måter i litteraturen. Nylige anstrengelser har forsøkt å standardisere eksperimentell design, utførelse og rapportering av dyrestudier26. Etterforskerne har ulike preferanser og teknikker tilpasset sine laboratorier. De fleste forskningsprosjekter er også unike på en måte som de krever noen protokoll modifikasjoner. På grunn av sykdoms multifaktoriell natur, varierer optimale kontroller mellom prosjekter. Lokale forhold og mangel på standardisering kan forårsake observerte forskjeller i sykdomsutvikling, som hemmer fremskritt av forskningen feltet. Forskjeller i eksperimentell variasjon betyr også at statistiske kraft beregninger må baseres på forsøks studier under lokale forhold.
Kvantifisering av aterosklerose er anbefalt på flere steder i det vaskulære treet. Denne protokollen beskriver hvordan du får resultater fra aorta roten, aorta buen, og truncus brachiocephalicus arterien i en enkelt mus, i tillegg til å forlate resten av thoracoabdominal aorta for andre analyser. En ansikt preparater tillate rask kvantifisering av lipid-Laden plaketter i aorta buen. Sykdoms byrde i truncus brachiocephalicus arterien kan også kvantifisert hvis prøvene er nøye vist. Jo mer tidkrevende kryss-snitting av aorta roten etterlater flere seksjoner tilgjengelig for detaljert evaluering av plakk sammensetning.
Kardiovaskulær sykdom er den viktigste morderen i verden og nye forebyggende målinger er nødvendig2. Mouse modeller av sykdommen gir en omfattende plattform for etterforskning av patofysiologi og eksperimentelle behandlinger13. Kvantifisering av pålitelig lesjon er viktig for denne tilnærmingen. Kvantifisering metoder varierer imidlertid mellom laboratorier. Standardisering og optimering ha blitt en igangværende forarbeide siden det 1980 ‘13,27,33,34. Aorta røtter har dukket opp som det mest populære området for å kvantifisere eksperimentelle aterosklerose. Tverrsnitt av plaketter gjør det mulig å sammenligne plakk volum mellom grupper. En ansikt preparater foretrekkes for lesjon kvantifisering i større segmenter av aorta. Den en ansikts metode visualiserer plakk kvantitet og muliggjør kvantifisering av plakk området dekning, men ikke ta plakk tykkelse i betraktning. Den biologiske relevansen for observerte forskjeller er dokumentert av sammenhengende resultater på forskjellige steder i det vaskulære treet. Vurderer aterosklerose utvikling på ulike steder adresser mulig områdespesifikke effekter. Effekten av transplantert blodkreft celler på aterosklerose utvikling kan vurderes i hypercholesterolemic Ldlr-/- chimeras. Men, hele kroppen bestråling påvirker aterosklerose prosessen med området spesifikke effekter. Mer fremtredende aterosklerotiske lesjoner er utviklet i aorta roten, mens redusert lesjon utvikling er observert i aorta buer35.
Viktigere, ikke bare lesjon størrelse må tas opp i studier av eksperimentell aterosklerose. Sammensetning av lesjon er også en nøkkel parameter. Flere plakk funksjoner har blitt assosiert med manifestasjoner av sykdommen hos mennesker36. Seriell snitting av aorta roten etterlater flere seksjoner tilgjengelig for nøye analyse av plakk sammensetning. Plakk brudd hos mennesker er preget av en tynn fiber lue med få glatte muskelceller, sparsom kollagen innhold og tegn på betennelse i plaketter36. Selv om plakk brudd er en sjelden hendelse i musemodeller av aterosklerose, markører for plakk stabilitet er informative å evaluere. Translational tilnærminger kan bekrefte mekanistisk funn fra musemodeller og avdekke viktige trekk ved menneskelig sykdom31. Inflammatorisk status aterosklerotiske plaketter kan bestemmes ved immunhistokjemi farging av VCAM-1, MHC klasse II, makrofager, og lymfocytter30. Noen protokoller bruker langsgående seksjoner i koronale planet av aorta buen eller truncus brachiocephalicus arterien for måling aterosklerotiske lesjon størrelse og sammensetning37. Imidlertid, denne alternativ metoden blader bare få avdelinger å bli analysert, hvilke rammer dens søknadene.
En innledende kritisk skritt i denne protokollen er evnen til å høste aortas effektivt. Hånd-øye-koordinasjon under mikroskopet krever praksis og er avgjørende både for microdissection og den påfølgende låsing av aorta buen. Det neste kritiske trinnet i denne protokollen er samlingen av serielle seksjoner fra aorta roten. 80 påfølgende seksjoner skal samles for hver mus, som krever både fokus og tålmodighet. Metodisk kompetanse kan øke hastigheten på de beskrevne prosessene betraktelig. Likevel er aterosklerotiske lesjon kvantifisering fortsatt en tidkrevende oppgave. Ny teknologi, automatisert håndtering, og små dyr Imaging kan forenkle kvantifisering av eksperimentelle aterosklerose i fremtiden. Progresjon av aterosklerose er langsom og mest eksperimentelle protokoller i musemodeller ta mer enn fire måneder å fullføre13. Derfor må aortas samles på en optimalisert måte ved studie endepunkter. Denne protokollen gir en omfattende guide for å høste aortas effektivt og den foreslåtte behandlingen forbereder aortas for multi-purpose bruk inkludert lesjon kvantifisering i aorta rot, aorta Arch, og truncus brachiocephalicus arterien. Forhåpentligvis protokollen kan redusere eksperimentell variasjon, forbedre påliteligheten av resultater, og føre til funn som vil bane vei for nye behandlinger mot aterosklerose.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle tidligere medlemmer av Göran K Hansson eksperimentelle kardiovaskulær forskning enhet som bidro til å utvikle denne protokollen i løpet av det siste kvartalet-tallet. Vi er spesielt takknemlige for bidragene fra Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson og Inger Bodin. Dette arbeidet ble støttet av prosjekt stipend 06816 og von Linné støtte 349-2007-8703 fra det svenske Forskningsrådet, og ved tilskudd fra det svenske Heart-Lung Foundation, Stockholm County Council, professor Nanna Svartz stiftelse, LoO og hans Osterman Stiftelsen for medisinsk forskning, Karolinska Institutet ‘ s Research Foundation og Foundation for alders medisinske sykdommer ved Karolinska Institutet.
Acetone | VWR Chemicals | 20066.296 | For fixation of sections for immunohistochemistry. |
Black electrical insulation tape (50 mm wide) | Any specialized retailer | – | To create pinning beds for aortic arches. |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C | Benchtop microcentrifuge. |
Cork board | Any specialized retailer | – | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Cryostat | Thermo Scientific | Microm HM 560 | For serial cryosectioning of aortic roots. |
Deionized water | – | – | For rinsing and preparation of solutions. |
Digital camera | Leica Microsystems | DC480 | 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections. |
Dissecting scissors (10 cm, straight) | World Precision Instruments | 14393 | For general dissection of organs. |
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) | World Precision Instruments | 500341 | For microdissection of aorta. |
Ethanol 70% (v/v) | VWR Chemicals | 83801.290 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Ethanol absolute ≥99.8% | VWR Chemicals | 20821.310 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) | VWR Chemicals | 9713.1000 | Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
ImageJ | NIH | – | Image analysis software. |
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) | World Precision Instruments | 15915-G | Used as anatomical forceps. |
Isopropanol | Merck | 1096341011 | Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness. |
Kaiser's glycerol gelatine | Merck | 1092420100 | Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects. |
Light microscope | Leica Microsystems | DM LB2 | For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs. |
Mayer's hematoxylin | Histolab | 1820 | Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation. |
Mayo scissors (17 cm, straight) | World Precision Instruments | 501751-G | For general dissection. |
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) | World Precision Instruments | 503376 | For pinning of aortic arches. |
Microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-C | Polypropylene microtubes with snaplock cap. |
Microlance 3 needles, 23 gauge | BD | 300800 | For blood collection. |
Microlance 3 needles, 27 gauge | BD | 302200 | For perfusion of mice. |
Microvette 500 µL, K3 EDTA | Sarstedt | 20.1341.100 | For blood collection. |
Microvette 500 µL, Lithium Heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | For blood collection. |
Minutien insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | For pinning of aortic arches. |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount | Histolab | 45830 | For embedding tissue. |
Parafilm M | Bemis | PM992 | Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches. |
Petri dishes (100×20 mm) | Any cell culture supplier | – | Proposed as a storage container for pinned aortas. |
Phosphate buffered saline (PBS) | – | – | Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice. |
Qualitative filter paper (grade 1001) | Munktell | 120006 | For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm). |
RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76106 | For stabilization of RNA in tissue samples |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | A surface decontamination solution that destroys RNases on contact. |
Scalpel handle #3 (13 cm) | World Precision Instruments | 500236 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Standard scalpel blade #10 | World Precision Instruments | 500239 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ6 | For dissection and en face documentation |
Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Superfrost Plus microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | To collect aortic root sections. |
Tissue forceps (15 cm) | World Precision Instruments | 501741-G | For general dissection. |
Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm) | Sakura | 4565 | For embedding aortic roots in OCT. |
Vannas scissors (8 cm, straight) | World Precision Instruments | 503378 | For microdissection of aorta. |