CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.
CRISPR-Cas 시스템을 이용한 게놈 편집은 다양한 유기체의 게놈을 정밀하게 편집하는 능력을 크게 향상시켰습니다. 포유류 세포의 맥락에서, 이 기술은 기능적 유전체학 연구를 위한 게놈 전체 유전 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타낸다. 모든 개방된 판독 프레임을 대상으로 하는 가이드 RNA(sgRNA) 라이브러리는 특정 표현형에 대해 선별될 수 있는 단일 세포 풀에서 수천 개의 유전 적 교란을 생성하여 유전자 기능 및 세포 프로세스에 연루되도록 허용합니다. 편견과 체계적인 방법. CRISPR-Cas 스크린은 세포 표현형을 위한 유전 청사진을 밝히기 위하여 간단하고, 능률적이고, 저렴한 방법을 연구원에게 제공합니다. 게다가, 각종 세포주및 다른 암 모형에서 수행된 스크린의 차등 분석은 특정 항암 치료에 대한 잠재적인 표적을 드러내는 종양 세포에 문맥상 필수적인 유전자를 확인할 수 있습니다. 인간 세포에서 게놈 전체 스크린을 수행하는 것은 수천만 개의 세포를 처리하는 것을 포함하고 대량의 데이터 집합의 분석을 요구하기 때문에 어려울 수 있습니다. 세포주 특성화, CRISPR 라이브러리 고려 사항, 분석 중 CRISPR 기술의 한계와 기능 이해 와 같은 이러한 화면의 세부 사항은 종종 간과됩니다. 여기에 제공된 풀드게놈 전체 CRISPR-Cas9 기반 스크린의 성공적인 성능을 위한 상세한 프로토콜이 제공됩니다.
CRISPR-Cas는 정기적으로 스패니싱된 짧은 팔린드로믹 반복 및 CRISPR 관련 뉴클레아제에 대한 짧은, 합성 가이드 RNA(sgRNA)와 복합체에서 단일 뉴클레아제 단백질(예를 들어, Cas9)으로 구성된다. 이 리보뉴클레오 단백질 복합체는 Cas9 효소를 표적으로 하여 특정 게놈 궤적1에서이중 가닥 DNA 분리를 유도합니다. 이중 가닥 휴식은 상동성 지시 수리 (HDR) 또는, 더 일반적으로, 비 상동성 끝 접합을 통해 복구 할 수 있습니다 (NHEJ), 삽입 및 / 또는 삭제 (INDELS)를 자주 중단하는 오류 경향이 수리 메커니즘 1. CRISPR의 효율성과 단순성은 이전의 게놈 편집 기술 [즉, 아연 손가락 뉴클레아제 (ZNF) 또는 전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제 (nucleion)를 훨씬 능가하는 이전에 는 달성 할 수없는 수준의 게놈 표적화를 가능하게합니다. TALENS), 둘 다 높아진 설계 복잡성, 낮은 형질 감염 효율 및 멀티플렉스 유전자 편집의 한계로 고통받고있습니다 2].
CRISPR 단일 가이드 RNA 기반 게놈 편집의 기본 연구 응용 프로그램은 과학자들이 개별 유전자의 기능과 유전자 상호 작용 네트워크의 토폴로지의 기능을 효율적이고 저렴하게 심문할 수 있게 해 주어왔습니다. 기능적 게놈 전체 스크린을 수행하는 능력은 CRISPR-Cas 시스템의 사용에 의해 크게 향상되었습니다, 특히 RNA 간섭과 같은 초기 유전 섭동 기술과 비교할 때 (RNAi) 및 유전자 트랩 돌연변이 발생. 특히, RNAi는 높은 오프 타겟 효과와 불완전한 녹다운으로 고통받고 있으며, CRISPR3,4,5에비해 감도와 특이성이 낮으며 유전자 트랩 방법은 haploid에서만 가능합니다. 기능 상실 스크린을 위한 셀, 심문될 수 있는 세포 모형의 범위를 제한하는6. 완전한 유전자 녹아웃을 생성하는 CRISPR의 능력은 낮은 소음, 최소한의 오프 타겟 효과 및 시약 전반에 걸쳐 일관된 활성으로 돌연변이 표현형을 심문하는 보다 생물학적으로 견고한 시스템을 제공합니다5. 전체 인간 게놈을 표적으로 하는 CRISPR-Cas9 sgRNA 라이브러리는 이제 널리 사용가능하여 단일 실험3,7,8,9에서 수천 개의 유전자 녹아웃을 동시에 생성할 수 있습니다. .
우리는 고해상도 기능 유전체 학 스크린을 용이하게하기 위해 컴팩트하고 시퀀스 최적화 된 토론토 녹아웃 (TKO) 라이브러리 (Addgene를 통해 사용 가능)라는 독특한 CRISPR-Cas9 게놈 넓은 sgRNA 렌티 바이러스 라이브러리를 개발했습니다. 최신 라이브러리인 TKOv3는 경험적 데이터를 사용하여 편집 효율에 최적화된 71,090개의 가이드를 사용하여 ~18,000개의 인간 단백질 코딩 유전자를 대상으로합니다 10. 또한 TKOv3는 단일 벡터에서 Cas9 및 sgRNAs를 발현하는 단일 구성 요소 라이브러리(LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294)로 사용할 수 있으므로 안정적인 Cas9 발현 셀을 생성할 필요성을 완화하여 광범위한 범위에서 게놈 전체 녹아웃을 가능하게 합니다. 포유류 세포 유형. TKOv3는 Cas9(pLCKO2:TKOv3, Addgene ID# 125517)가 없는 벡터에서도 사용할 수 있으며 Cas911을발현하는 셀에서 활용될 수 있다.
게놈 넓은 CRISPR-Cas9 편집된 세포 인구는 다른 성장 조건에 드러낼 수 있고, 차세대 염기서열로 정량화된 sgRNAs의 풍부와 함께, 추적 가능한 유전을 가진 세포의 중퇴 또는 농축을 평가하기 위하여 판독을 제공하 교란. CRISPR 녹아웃 라이브러리는 섭동시, 세포 적당 결함, 적당한 약물 민감도(예: 민감하거나 내성 있는 유전자), 단백질 발현 조절(예: 리포터) 또는 특정에 필요한 유전자를 식별하기 위해 활용될 수 있습니다. 통로 기능 및 세포 상태12,13,14. 예를 들어, 암 세포주에서의 차동 피트니스 스크린은 종양 억제유전자 유전자3,14,15의고갈 또는 감소 또는 종양 억제유전자의 증가를 식별할 수 있다. 유사하게, 치료약물의 중간 용량을 사용하면 약물 내성 및 과민성 유전자 둘 다 를 나타낼 수있다 16,17.
여기에 제공된 유전체 스케일 CRISPR-Cas9 기능 손실 스크리닝을 위한 상세한 스크리닝 프로토콜은 라이브러리 생성으로부터 포유류 세포에서 토론토 녹아웃 라이브러리(TKOv1 또는 v3)를 사용하여, 데이터 분석에 대한 스크리닝 성능이다. 이 프로토콜은 토론토 녹아웃 라이브러리를 사용하여 스크리닝에 최적화되었지만 모든 CRISPR sgRNA 풀린 라이브러리에 적용하여 확장 가능해질 수 있습니다.
사용의 단순성과 높은 유연성으로 인해 CRISPR 기술은 정밀한 게놈 편집을 위한 도구로 널리 채택되었습니다. 풀린 CRISPR 스크리닝은 단일 실험에서 수천 개의 유전적 교란을 심문하는 방법을 제공합니다. 풀린 스크린에서, sgRNA 라이브러리는 각 순서가 고유하고 표적으로 한 유전자에 매핑되기 때문에 분자 바코드로 봉사합니다. 세포 집단으로부터 게놈 DNA를 분리함으로써, 관심표현형을 일으키는 …
The authors have nothing to disclose.
이 일은 게놈 캐나다, 온타리오 연구 기금 및 건강 연구를 위한 캐나다 학회 (MOP-142375, PJT-148802)에 의해 지원되었습니다.
0.22 micron filter | |||
30°C plate incubator | |||
37°C shaking incubator | |||
37°C, 5% CO2 incubator | |||
5 M NaCl | Promega | V4221 | |
50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
95% Ethanol | |||
Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
Electroporator | BTX | 45-0651 | |
Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
LB agar plates with carbenicillin | |||
LB medium with carbenicillin | |||
Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |