Summary

Évaluation des interactions protéines-protéines à l'aide d'une technique de digestion on-Membrane

Published: July 19, 2019
doi:

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour une technique de digestion on-membrane pour la préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse. Cette technique facilite l’analyse pratique des interactions protéines-protéines.

Abstract

De nombreuses protéines intracellulaires interagissent physiquement en fonction de leurs circonstances intracellulaires et extracellulaires. En effet, les fonctions cellulaires dépendent en grande partie des interactions protéines intracellulaires. Par conséquent, la recherche concernant ces interactions est indispensable pour faciliter la compréhension des processus physiologiques. La co-précipitation des protéines associées, suivie de l’analyse de la spectrométrie de masse (SP), permet d’identifier de nouvelles interactions protéiques. Dans cette étude, nous avons fourni des détails de la nouvelle technique de l’analyse immunoprécipitation-chromatographie liquide (LC)-MS/MS combinée à la digestion on-membrane pour l’analyse des interactions protéines-protéines. Cette technique convient aux immunoprécipitants bruts et peut améliorer le débit des analyses protéomiques. Les protéines recombinantes marquées ont été précipitées à l’aide d’anticorps spécifiques; ensuite, les immunoprecipitants effacés sur les morceaux de membrane de difluorure de polyvinylidene ont été soumis à l’alkylation réductrice. Après la trypsinisation, les résidus de protéines digérées ont été analysés à l’aide de LC-MS/MS. En utilisant cette technique, nous avons pu identifier plusieurs protéines associées candidates. Ainsi, cette méthode est pratique et utile pour la caractérisation de nouvelles interactions protéines-protéines.

Introduction

Bien que les protéines jouent un rôle constitutif dans les organismes vivants, elles sont continuellement synthétisées, traitées et dégradées dans l’environnement intracellulaire. En outre, les protéines intracellulaires interagissent fréquemment physiquement et biochimiquement, ce qui affecte la fonction d’un ou des deux1,2,3. Par exemple, la liaison directe de l’homolog de protéine spliceosome-associé CWC22 avec le facteur d’initiation de traduction eucaryotique 4A3 (eIF4A3) est nécessaire pour l’assemblage du complexe de jonction d’exon4. Conformément à cela, un mutant eIF4A3 qui manque d’affinité pour CWC22 ne parvient pas à faciliter l’épissage de l’ARNm à jonction exon complexe-conduit4. Ainsi, l’étude des interactions protéiques est cruciale pour la compréhension précise de la régulation physiologique ainsi que des fonctions cellulaires.

Des progrès récents dans la spectrométrie de masse (SeP) ont été appliqués à l’analyse complète des interactions protéines-protéines. Par exemple, la co-précipitation de protéines endogènes ou de protéines étiquetées introduites exogènement avec leurs protéines associées, suivie s’il y a une analyse de la SP, permet d’identifier de nouvelles interactions protéiques5. Cependant, un goulot d’étranglement majeur de l’analyse de la SP/SP est la récupération médiocre des digests tryptiques des échantillons de protéines. Pour effectuer des analyses protéomiques sur les lysates cellulaires, des techniques de digestion en gel et à la membrane sont généralement utilisées pour préparer des échantillons de SP/SP. Nous avons précédemment comparé une procédure de digestion dans-gel avec une technique de digestion sur-membrane6, et a montré que ce dernier a été associé à une meilleure couverture de séquence. La membrane du difluorure de polyvinylidene (PVDF) peut convenir à cette fin parce qu’elle est mécaniquement robuste et résistante aux fortes concentrations de solvants organiques7,8, permettant la digestion enzymatique des immobilisés protéines en présence de 80% d’acétonitrile9. En outre, l’immobilisation sur une membrane peut induire des changements conformationnels dans les protéines cibles, conduisant à des améliorations de l’efficacité de la digestion tryptique10. En conséquence, dans cet article, nous avons décrit l’utilisation de l’analyse immunoprécipitation-LC/MS/MS des interactions de protéine utilisant une technique de digestion sur-membrane. Cette méthode simple facilite l’analyse pratique des interactions protéines-protéines, même dans les laboratoires non spécialisés.

Protocol

1. Immunoprécipitation REMARQUE : Nous avons utilisé le tampon de lyse et d’élution de lyse de dodecyl de non-sodium (SDS), tel que décrit dans les sections suivantes. Cependant, l’utilisation d’une autre technique interne d’immunoprécipitation peut également être applicable pour la préparation d’échantillons de LC-MS/MS. Cellules cultivées transfect avec des vecteurs codant une étiquette d’épitope seule ou une protéine de fusion. Pour l’acquisition de données représen…

Representative Results

Au moyen de la procédure décrite ci-dessus, les immunoprécitants ont été analysés à l’aide de LC-MS/MS (figure 1). Après l’exclusion des protéines exogènes dérivées (protéines d’autres espèces et IgG), 17 protéines ont été identifiées chez des immunoprecipitants associés au calpain-6 (tableau 1) et 15 protéines ont été identifiées chez des immunoprecipitants associés au GFP ( Tableau 2). Parmi les prot…

Discussion

Nous avons précédemment décrit une analyse des modifications oxydatives de l’apolipoprotéine B-100 dans la lipoprotéine de basse densité oxydée utilisant LC-MS/MS précédée d’une technique de digestion on-membrane6. Dans la présente étude, nous avons combiné cette technique avec l’immunoprécipitation et avons identifié plusieurs protéines calpain-6-associées. Cette nouvelle technique représente une méthode pratique de dépistage des protéines associées aux candidats. Calpain-6 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue en partie par la Société japonaise pour la promotion de la science KAKENHI Grant Number 17K09869 (à AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), une subvention de recherche de Kanehara Ichiro Medical Science Foundation et une subvention de recherche de la Suzuken Memorial Foundation (tous à TM).

Materials

Acetonitrile Wako 014-00386
Citric acid Wako 030-05525
DiNA KYA Tech Co. nanoflow high-performance liquid chromatography
DiNa AI KYA Tech Co. nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler
DTT Nacalai tesque 14112-94
Dynabeads protein G Thermo Fisher Scientific 10003D
Formic acid Wako 066-00461
HiQ Sil C18W-3 KYA Tech Co. E03-100-100 0.10mmID * 100mmL
Iodoacetamide Wako 095-02151
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000008
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) Clontech 632380
NaCl Wako 191-01665
NH4HCO3 Wako 018-21742
Nonidet P-40 Sigma N6507 poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)
peptide standard KYA Tech Co. tBSA-04 tryptic digests of bovine serum albumin
PP vial KYA Tech Co. 03100S plastic sample tube
Protease inhibitor cooctail Sigma P8465
ProteinPilot software Sciex 5034057 software for protein identification
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111 trypsin
Sodium orthovanadate Sigma S6508
Sodium phosphate dibasic dihydrate Sigma 71643
TFA Wako 206-10731
trap column KYA Tech Co. A03-05-001 0.5mmID * 1mmL
TripleTOF 5600 system Sciex 4466015 Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer
Tris Wako 207-06275
Tween-20 Wako 160-21211

References

  1. Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
  2. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
  3. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
  4. Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
  5. Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
  6. Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
  7. Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
  8. Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
  9. Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
  10. Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
  11. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
  12. Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
  13. Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
  14. Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
  15. Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).

Play Video

Cite This Article
Obama, T., Miyazaki, T., Aiuchi, T., Miyazaki, A., Itabe, H. Evaluation of Protein–Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique. J. Vis. Exp. (149), e59733, doi:10.3791/59733 (2019).

View Video