Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica da digestão da em-membrana para a preparação das amostras para a espectrometria maciça. Esta técnica facilita a análise conveniente das interações proteína-proteína.
Abstract
As proteínas intracelular numerosas interagem fisicamente de acordo com suas circunstâncias intracelular e extracelular. De fato, as funções celulares dependem em grande parte das interações proteína-proteína intracelular. Portanto, a pesquisa sobre essas interações é indispensável para facilitar a compreensão dos processos fisiológicos. A co-precipitação das proteínas associadas, seguida pela análise de espectrometria de massas (MS), possibilita a identificação de novas interações proteicas. Neste estudo, nós fornecemos detalhes da técnica nova da imunoprecipitação-cromatografia líquida (LC)-análise de MS/MS combinada com a digestão da em-membrana para a análise de interações da proteína-proteína. Esta técnica é apropriada para immunoprecipitants crus e pode melhorar a produção de análises proteômica. As proteínas recombinantes marcadas foram precipitadas com anticorpos específicos; em seguida, os immunoprecipitants inchados em partes da membrana do difluluoreto do polyvinylidene foram sujeitados ao alkylation redutora. Após a tripsinização, os resíduos de proteínas digeridas foram analisados utilizando-se LC-MS/MS. utilizando esta técnica, pudemos identificar várias proteínas associadas a candidatos. Assim, esse método é conveniente e útil para a caracterização de novas interações proteína-proteína.
Introduction
Embora as proteínas desempenham papéis constitutivos em organismos vivos, eles são continuamente sintetizados, processados e degradadas no ambiente intracelular. Além disso, as proteínas intracelulares freqüentemente interagem fisicamente e bioquimicamente, o que afeta a função de um ou ambos1,2,3. Por exemplo, a ligação direta do homólogo CWC22 da proteína do spliceosome-associado com o fator 4a3 da iniciação da tradução eucarióticas (eIF4A3) é necessário para a montagem do complexo4da junção do eXoN. Consistente com isso, um mutante eIF4A3 que carece de afinidade por CWC22 não consegue facilitar a junção de exon emenda de mRNA de complexo-driven4. Assim, o estudo das interações protéicas é crucial para a compreensão precisa da regulação fisiológica, bem como das funções celulares.
Os avanços recentes na espectrometria maciça (MS) foram aplicados à análise detalhada de interações da proteína-proteína. Por exemplo, a coprecipitação de proteínas endógenas ou de proteínas marcadas com as proteínas associadas, seguida pela análise de MS, possibilita a identificação de novas interações protéicas5. Entretanto, um grande gargalo da análise de MS/MS é recuperação pobre das escavações tríptico de amostras da proteína. Para a realização de análises proteômicas em lisados celulares, as técnicas de digestão em gel e na membrana são geralmente empregadas para preparar amostras de MS/MS. Nós temos comparado previamente um procedimento da digestão do em-gel com uma técnica da digestão da em-membrana6, e mostramos que o último estêve associado com a melhor cobertura da seqüência. A membrana do difluoreto do polyvinylidene (PVDF) pode ser apropriada para esta finalidade porque é mecanicamente robusta e resistente às concentrações elevadas de solventes orgânicos7,8, permitindo a digestão enzimática de imobilizados proteínas na presença de 80% acetonitrila9. Além disso, a imobilização em uma membrana pode induzir alterações conformacionais nas proteínas alvo, levando a melhorias na eficiência da digestão tripética10. Consequentemente, neste artigo, nós descrevemos o uso da análise da imunoprecipitação-LC/MS/MS de interações da proteína usando uma técnica da digestão da em-membrana. Este método simples facilita a análise conveniente de interações proteína-proteína mesmo em laboratórios não-especializados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos previamente uma análise das modificações oxidativas do apolipoproteína B-100 na lipoproteína de baixa densidade oxidado usando LC-MS/MS precedido por uma técnica da digestão da em-membrana6. No presente estudo, combinamos esta técnica com imunoprecipitação e identificamos várias proteínas associadas ao calpain-6. Esta técnica nova representa um método conveniente da seleção para proteínas associadas do candidato. Calpain-6 é um membro não-proteolítico da famíl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado em parte pela sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI conceder número 17K09869 (para AM), a sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI Grant Number 15K09418 (para TM), uma bolsa de pesquisa da Kanehara Ichiro Medical Science Foundation e uma bolsa de pesquisa da Suzuken Memorial Foundation (tudo para TM).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
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