Utvärdering av protein-proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för en membran matsmältning teknik för beredning av prover för masspektrometri. Denna teknik underlättar den praktiska analysen av protein-proteininteraktioner.
Abstract
Många intracellulära proteiner interagerar fysiskt i enlighet med deras intracellulära och extracellulära omständigheter. Faktum cellulära funktioner beror till stor del på intracellulära protein-protein interaktioner. Därför är forskning om dessa interaktioner oumbärlig för att underlätta förståelsen av fysiologisk processer. Samfällning av associerade proteiner, följt av masspektrometri (MS) analys, möjliggör identifiering av nya proteininteraktioner. I denna studie har vi tillhandahållit Detaljer om den nya tekniken för immunoprecipitation-vätskekromatografi (LC)-MS/MS-analys kombinerat med på-membran nedbrytning för analys av protein-proteininteraktioner. Denna teknik är lämplig för rå immunoprecipitants och kan förbättra genomströmningen av proteomiska analyser. Märkta rekombinanta proteiner fälldes med hjälp av specifika antikroppar; Nästa, immunoprecipitants utblottade på av polyvinylidenklorid vinylidendifluorid membran bitar utsattes för reduktiv alkylering. Efter trypsinization analyserades de smälta proteinhalterna med LC-MS/MS. med hjälp av denna teknik, kunde vi identifiera flera kandidat associerade proteiner. Sålunda, denna metod är bekvämt och användbart för karakterisering av nya protein-protein interaktioner.
Introduction
Även om proteiner spelar konstitutiva roller i levande organismer, de är ständigt syntetiseras, bearbetas, och degraderas i den intracellulära miljön. Vidare samverkar intracellulära proteiner ofta fysiskt och biokemiskt, vilket påverkar funktionen hos en eller båda1,2,3. Till exempel, den direkta bindningen av spliceosome-associerade protein homolog CWC22 med eukaryotisk översättning initierings faktor 4A3 (eIF4A3) är nödvändig för montering av exon Junction Complex4. I överensstämmelse med detta, en eIF4A3 Mutant som saknar samhörighet för CWC22 misslyckas med att underlätta exon Junction Complex-driven mRNA splitsning4. Således är studiet av proteininteraktioner avgörande för den exakta förståelsen av fysiologisk reglering och cellulära funktioner.
De senaste framstegen inom masspektrometri (MS) har tillämpats på den omfattande analysen av protein-proteininteraktioner. Till exempel, samfällning av endogena proteiner eller exogent introducerade märkta proteiner med tillhörande proteiner, följt av MS-analys, möjliggör identifiering av nya proteininteraktioner5. En stor flaskhals av MS/MS-analys är dock dålig återhämtning från tryptic sammandrag av protein prover. För att utföra proteomiska analyser på cell Lysates, i-gel och på membran matsmältningen tekniker är i allmänhet används för att förbereda MS/MS prover. Vi har tidigare jämfört en in-gel rötning förfarande med en on-membran digestionsteknik6, och visade att den senare var förknippad med bättre sekvens täckning. Polyvinylidene difluorid (PVDF) membran kan vara lämplig för detta ändamål eftersom det är mekaniskt robust och motståndskraftig mot höga koncentrationer av organiska lösningsmedel7,8, vilket möjliggör enzymatisk nedbrytning av immobiliserade proteiner i närvaro av 80% acetonitril9. Dessutom kan immobilisering på ett membran inducera kon Formations förändringar i målproteiner, vilket leder till förbättringar i tryptic rötnings effektivitet10. Följaktligen, i denna artikel, vi har beskrivit användningen av immunoprecipitation-LC/MS/MS-analys av proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik. Denna enkla metod underlättar den praktiska analysen av protein-protein interaktioner även i icke-specialiserade laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har tidigare beskrivit en analys av de oxidativa modifieringarna av apolipoprotein B-100 i oxiderat low-density lipoprotein med LC-MS/MS, föregånget av en membran matsmältning teknik6. I den nuvarande studien kombinerade vi denna teknik med immunoprecipitation och har identifierat flera calpain-6-associerade proteiner. Denna nya teknik utgör en bekväm metod för screening för kandidat proteiner. Calpain-6 är en icke-proteolytisk medlem av calpain proteolytiska familj11<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes delvis av Japan Society för främjande av vetenskap KAKENHI Grant Number 17K09869 (till AM), Japan Society för främjande av vetenskap KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), ett forskningsanslag från Kanehara Ichiro Medical Science Foundation och ett forskningsanslag från Suzuken Memorial Foundation (all to TM).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
