Summary

Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Published: July 19, 2019
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para una técnica de digestión en la membrana para la preparación de muestras para espectrometría de masas. Esta técnica facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína.

Abstract

Numerosas proteínas intracelulares interactúan físicamente de acuerdo con sus circunstancias intracelulares y extracelulares. De hecho, las funciones celulares dependen en gran medida de las interacciones proteína-proteína intracelular. Por lo tanto, la investigación sobre estas interacciones es indispensable para facilitar la comprensión de los procesos fisiológicos. La co-precipitación de proteínas asociadas, seguida de un análisis de espectrometría de masas (EM), permite la identificación de nuevas interacciones proteicas. En este estudio, hemos proporcionado detalles de la novedosa técnica de la cromatografía inmunoprecipitada-líquido (LC)-MS/MS combinado con la digestión en la membrana para el análisis de interacciones proteína-proteína. Esta técnica es adecuada para inmunoprecipitados crudos y puede mejorar el rendimiento de los análisis proteómicos. Las proteínas recombinantes etiquetadas se precipitaron utilizando anticuerpos específicos; a continuación, los inmunoprecipitados borrados en piezas de membrana de difluoruro de polivinilideno fueron sometidos a alquilación reductiva. Después de la tripinización, los residuos de proteínas digeridas se analizaron utilizando LC-MS/MS. Usando esta técnica, pudimos identificar varias proteínas asociadas candidatas. Por lo tanto, este método es conveniente y útil para la caracterización de nuevas interacciones proteína-proteína.

Introduction

Aunque las proteínas desempeñan un papel constitutivo en los organismos vivos, se sintetizan, procesan y degradan continuamente en el entorno intracelular. Además, las proteínas intracelulares interactúan con frecuencia física y bioquímicamente, lo que afecta a la función de uno o ambos1,2,3. Por ejemplo, la unión directa del homólogo proteico asociado al esferoctico CWC22 con el factor de inicio de latraslación eucariota 4A3 (eIF4A3) es necesaria para el montaje del complejo de unión de exón 4. En consonancia con esto, un mutante eIF4A3 que carece de afinidad por CWC22 no facilita el empalme de ARNm impulsado por el complejo de cruces de exón4. Por lo tanto, el estudio de las interacciones proteicas es crucial para la comprensión precisa de la regulación fisiológica, así como de las funciones celulares.

Los avances recientes en espectrometría de masas (EM) se han aplicado al análisis exhaustivo de las interacciones proteína-proteína. Por ejemplo, la co-precipitación de proteínas endógenas o proteínas etiquetadas introducidas exógenamente con sus proteínas asociadas, seguida según el análisis de la EP, permite la identificación de nuevas interacciones proteicas5. Sin embargo, uno de los principales cuellos de botella del análisis de la SM/MS es la mala recuperación de los resúmenes trípticos de las muestras de proteínas. Para realizar análisis proteómicos en los lysatos celulares, generalmente se emplean técnicas de digestión en gel y en membrana para preparar muestras de MS/MS. Hemos comparado previamente un procedimiento de digestión en gel con una técnica de digestión en la membrana6, y hemos demostrado que este último se asoció con una mejor cobertura de secuencia. La membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) puede ser adecuada para este fin, ya que es mecánicamente robusta y resistente a altas concentraciones de disolventes orgánicos7,8, lo que permite la digestión enzimática de inmovilizados proteínas en presencia de 80% acetonitrilo9. Además, la inmovilización en una membrana puede inducir cambios de conformación en las proteínas diana, lo que conduce a mejoras en la eficiencia de la digestión tríptica10. En consecuencia, en este artículo, hemos descrito el uso del análisis de inmunoprecipitación-LC/MS/MS de interacciones proteicas utilizando una técnica de digestión en la membrana. Este sencillo método facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína incluso en laboratorios no especializados.

Protocol

1. Inmunoprecipitación NOTA: Utilizamos tampón de lisis dodecilo no sódico (SDS) y elución de citrato, como se describe en las secciones siguientes. Sin embargo, el uso de una técnica alternativa de inmunoprecipitación interna también puede ser aplicable para preparar muestras LC-MS/MS. Células cultivadas transfectos con vectores que codifican una etiqueta de epítopos solo o una proteína de fusión. Para adquirir datos representativos, transfiera células J774 (1 x 106…

Representative Results

Mediante el procedimiento descrito anteriormente, se analizaron los inmunoprecipitantes utilizando LC-MS/MS (Figura1). Después de la exclusión de proteínas derivadas exógenamente (proteínas de otras especies e IgG), se identificaron 17 proteínas en inmunoprecipitantes asociados con calpato-6 (Tabla 1) y se identificaron 15 proteínas en inmunoprecipitantes asociados a la PTF ( Tabla 2). De las proteínas asociadas al ca…

Discussion

Hemos descrito previamente un análisis de las modificaciones oxidativas de la apolipoproteína B-100 en lipoproteínas oxidadas de baja densidad utilizando LC-MS/MS precedida por una técnica de digestión en membrana6. En el presente estudio, combinamos esta técnica con la inmunoprecipitación y hemos identificado varias proteínas asociadas al calpain-6. Esta novedosa técnica representa un método conveniente de detección de proteínas asociadas a los candidatos. Calpain-6 es un miembro no p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado en parte por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI Grant Number 17K09869 (a AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), una beca de investigación de Kanehara Ichiro Medical Science Foundation y una beca de investigación de Suzuken Memorial Foundation (todo a TM).

Materials

Acetonitrile Wako 014-00386
Citric acid Wako 030-05525
DiNA KYA Tech Co. nanoflow high-performance liquid chromatography
DiNa AI KYA Tech Co. nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler
DTT Nacalai tesque 14112-94
Dynabeads protein G Thermo Fisher Scientific 10003D
Formic acid Wako 066-00461
HiQ Sil C18W-3 KYA Tech Co. E03-100-100 0.10mmID * 100mmL
Iodoacetamide Wako 095-02151
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000008
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) Clontech 632380
NaCl Wako 191-01665
NH4HCO3 Wako 018-21742
Nonidet P-40 Sigma N6507 poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)
peptide standard KYA Tech Co. tBSA-04 tryptic digests of bovine serum albumin
PP vial KYA Tech Co. 03100S plastic sample tube
Protease inhibitor cooctail Sigma P8465
ProteinPilot software Sciex 5034057 software for protein identification
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111 trypsin
Sodium orthovanadate Sigma S6508
Sodium phosphate dibasic dihydrate Sigma 71643
TFA Wako 206-10731
trap column KYA Tech Co. A03-05-001 0.5mmID * 1mmL
TripleTOF 5600 system Sciex 4466015 Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer
Tris Wako 207-06275
Tween-20 Wako 160-21211

References

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Cite This Article
Obama, T., Miyazaki, T., Aiuchi, T., Miyazaki, A., Itabe, H. Evaluation of Protein–Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique. J. Vis. Exp. (149), e59733, doi:10.3791/59733 (2019).

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