Summary

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Published: July 19, 2019
doi:

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica da digestão da em-membrana para a preparação das amostras para a espectrometria maciça. Esta técnica facilita a análise conveniente das interações proteína-proteína.

Abstract

As proteínas intracelular numerosas interagem fisicamente de acordo com suas circunstâncias intracelular e extracelular. De fato, as funções celulares dependem em grande parte das interações proteína-proteína intracelular. Portanto, a pesquisa sobre essas interações é indispensável para facilitar a compreensão dos processos fisiológicos. A co-precipitação das proteínas associadas, seguida pela análise de espectrometria de massas (MS), possibilita a identificação de novas interações proteicas. Neste estudo, nós fornecemos detalhes da técnica nova da imunoprecipitação-cromatografia líquida (LC)-análise de MS/MS combinada com a digestão da em-membrana para a análise de interações da proteína-proteína. Esta técnica é apropriada para immunoprecipitants crus e pode melhorar a produção de análises proteômica. As proteínas recombinantes marcadas foram precipitadas com anticorpos específicos; em seguida, os immunoprecipitants inchados em partes da membrana do difluluoreto do polyvinylidene foram sujeitados ao alkylation redutora. Após a tripsinização, os resíduos de proteínas digeridas foram analisados utilizando-se LC-MS/MS. utilizando esta técnica, pudemos identificar várias proteínas associadas a candidatos. Assim, esse método é conveniente e útil para a caracterização de novas interações proteína-proteína.

Introduction

Embora as proteínas desempenham papéis constitutivos em organismos vivos, eles são continuamente sintetizados, processados e degradadas no ambiente intracelular. Além disso, as proteínas intracelulares freqüentemente interagem fisicamente e bioquimicamente, o que afeta a função de um ou ambos1,2,3. Por exemplo, a ligação direta do homólogo CWC22 da proteína do spliceosome-associado com o fator 4a3 da iniciação da tradução eucarióticas (eIF4A3) é necessário para a montagem do complexo4da junção do eXoN. Consistente com isso, um mutante eIF4A3 que carece de afinidade por CWC22 não consegue facilitar a junção de exon emenda de mRNA de complexo-driven4. Assim, o estudo das interações protéicas é crucial para a compreensão precisa da regulação fisiológica, bem como das funções celulares.

Os avanços recentes na espectrometria maciça (MS) foram aplicados à análise detalhada de interações da proteína-proteína. Por exemplo, a coprecipitação de proteínas endógenas ou de proteínas marcadas com as proteínas associadas, seguida pela análise de MS, possibilita a identificação de novas interações protéicas5. Entretanto, um grande gargalo da análise de MS/MS é recuperação pobre das escavações tríptico de amostras da proteína. Para a realização de análises proteômicas em lisados celulares, as técnicas de digestão em gel e na membrana são geralmente empregadas para preparar amostras de MS/MS. Nós temos comparado previamente um procedimento da digestão do em-gel com uma técnica da digestão da em-membrana6, e mostramos que o último estêve associado com a melhor cobertura da seqüência. A membrana do difluoreto do polyvinylidene (PVDF) pode ser apropriada para esta finalidade porque é mecanicamente robusta e resistente às concentrações elevadas de solventes orgânicos7,8, permitindo a digestão enzimática de imobilizados proteínas na presença de 80% acetonitrila9. Além disso, a imobilização em uma membrana pode induzir alterações conformacionais nas proteínas alvo, levando a melhorias na eficiência da digestão tripética10. Consequentemente, neste artigo, nós descrevemos o uso da análise da imunoprecipitação-LC/MS/MS de interações da proteína usando uma técnica da digestão da em-membrana. Este método simples facilita a análise conveniente de interações proteína-proteína mesmo em laboratórios não-especializados.

Protocol

1. imunoprecipitação Nota: utilizou-se tampão de lise de sulfato de dodecilo (SDS) não-sódico e eluição de citrato, conforme descrito nas seções a seguir. No entanto, o uso de uma técnica de imunoprecipitação em casa alternativa pode ser também aplicável para a preparação de amostras de LC-MS/MS. Transfect cultivou pilhas com os vetores que codificam um Tag do epítopo sozinho ou uma proteína da fusão. Para a aquisição de dados representativos, transferir J774 cé…

Representative Results

Por meio do procedimento descrito acima, os imunoprecipitantes foram analisados utilizando-se LC-MS/MS (Figura 1). Após a exclusão de proteínas derivadas exogenamente (proteínas de outras espécies e IgGs), 17 proteínas foram identificadas em imunoprecipitantes associados ao calpain-6 (tabela 1) e 15 proteínas foram identificadas em imunoprecipitantes associados à GFP ( Tabela 2). Das proteínas calpain-6 e GFP-associa…

Discussion

Nós descrevemos previamente uma análise das modificações oxidativas do apolipoproteína B-100 na lipoproteína de baixa densidade oxidado usando LC-MS/MS precedido por uma técnica da digestão da em-membrana6. No presente estudo, combinamos esta técnica com imunoprecipitação e identificamos várias proteínas associadas ao calpain-6. Esta técnica nova representa um método conveniente da seleção para proteínas associadas do candidato. Calpain-6 é um membro não-proteolítico da famíl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado em parte pela sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI conceder número 17K09869 (para AM), a sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI Grant Number 15K09418 (para TM), uma bolsa de pesquisa da Kanehara Ichiro Medical Science Foundation e uma bolsa de pesquisa da Suzuken Memorial Foundation (tudo para TM).

Materials

Acetonitrile Wako 014-00386
Citric acid Wako 030-05525
DiNA KYA Tech Co. nanoflow high-performance liquid chromatography
DiNa AI KYA Tech Co. nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler
DTT Nacalai tesque 14112-94
Dynabeads protein G Thermo Fisher Scientific 10003D
Formic acid Wako 066-00461
HiQ Sil C18W-3 KYA Tech Co. E03-100-100 0.10mmID * 100mmL
Iodoacetamide Wako 095-02151
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000008
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) Clontech 632380
NaCl Wako 191-01665
NH4HCO3 Wako 018-21742
Nonidet P-40 Sigma N6507 poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)
peptide standard KYA Tech Co. tBSA-04 tryptic digests of bovine serum albumin
PP vial KYA Tech Co. 03100S plastic sample tube
Protease inhibitor cooctail Sigma P8465
ProteinPilot software Sciex 5034057 software for protein identification
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111 trypsin
Sodium orthovanadate Sigma S6508
Sodium phosphate dibasic dihydrate Sigma 71643
TFA Wako 206-10731
trap column KYA Tech Co. A03-05-001 0.5mmID * 1mmL
TripleTOF 5600 system Sciex 4466015 Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer
Tris Wako 207-06275
Tween-20 Wako 160-21211

References

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Cite This Article
Obama, T., Miyazaki, T., Aiuchi, T., Miyazaki, A., Itabe, H. Evaluation of Protein–Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique. J. Vis. Exp. (149), e59733, doi:10.3791/59733 (2019).

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