Evaluering av protein-protein interaksjoner ved hjelp av en on-membran fordøyelsen Technique
Summary
Her presenterer vi en protokoll for en on-membran fordøyelsen teknikk for utarbeidelse av prøver for masse massespektrometri. Denne teknikken forenkler praktisk analyse av protein-protein interaksjoner.
Abstract
Tallrike intracellulære proteiner fysisk samhandler i samsvar med deres intracellulære og ekstracellulære omstendigheter. Faktisk er cellulære funksjoner i stor grad avhengig av intracellulære protein-protein interaksjoner. Derfor forskning om disse interaksjoner er uunnværlig for å tilrettelegge forståelsen av fysiologiske prosesser. Co-utfelling av tilknyttede proteiner, etterfulgt av masse massespektrometri (MS) analyse, gjør det mulig identifisering av romanen protein interaksjoner. I denne studien har vi gitt detaljer om romanen teknikk av immunutfelling-flytende kromatografi (LC)-MS/MS analyse kombinert med on-membran fordøyelsen for analyse av protein-protein interaksjoner. Denne teknikken er egnet for råolje immunoprecipitants og kan forbedre gjennomstrømningen av Proteomikk analyser. Tagged rekombinant proteiner ble utløst ved hjelp av spesifikke antistoffer; neste, immunoprecipitants blotted på Polyvinylidene polyvinylidenfluorid membran stykker ble utsatt for reductive alkylation. Etter trypsinization ble fordøyd protein rester analysert ved hjelp av LC-MS/MS. ved hjelp av denne teknikken, var vi i stand til å identifisere flere kandidat tilknyttede proteiner. Dermed er denne metoden praktisk og nyttig for karakterisering av romanen protein-protein interaksjoner.
Introduction
Selv om proteiner spiller konstituerende roller i levende organismer, blir de kontinuerlig syntetisert, bearbeidet og degradert i intracellulære miljø. Videre intracellulære proteiner ofte fysisk og biokjemisk samhandle, noe som påvirker funksjonen til en eller begge1,2,3. For eksempel, den direkte binding av spliceosome-assosiert protein homologe CWC22 med eukaryote oversettelse Initiation faktor 4A3 (eIF4A3) er nødvendig for montering av ekson Junction kompleks4. I samsvar med denne, en eIF4A3 mutant som mangler affinitet for CWC22 unnlater å lette ekson Junction kompleks-drevet mRNA skjøting4. Dermed er studiet av protein interaksjoner avgjørende for presis forståelse av fysiologiske regulering samt av cellulære funksjoner.
Nylige fremskritt i masse massespektrometri (MS) har blitt brukt på omfattende analyse av protein-protein interaksjoner. For eksempel, co-utfelling av endogene proteiner eller exogenously innført merkede proteiner med sine tilhørende proteiner, etterfulgt av MS analyse, gjør det mulig identifisering av romanen protein interaksjoner5. Imidlertid, ettall større flaskehalsen av MULTIPLE SCLEROSIS/MULTIPLE SCLEROSIS analyse er fattig det å bli frisk fra tryptic fordøyer av protein eksemplar. For å gjennomføre Proteomikk analyser på celle lysater, i-gel og på-membran fordøyelsen teknikker er generelt brukt til å forberede MS/MS prøver. Vi har tidligere sammenlignet en in-gel fordøyelsen prosedyre med en on-membran fordøyelsen teknikk6, og viste at sistnevnte var assosiert med bedre sekvensdekning. Polyvinylidene polyvinylidenfluorid (PVDF) membran kan være egnet for dette formålet fordi det er mekanisk robust og motstandsdyktig mot høye konsentrasjoner av organiske løsemidler7,8, tillater enzymatisk fordøyelse av immobilisert proteiner i nærvær av 80% acetonitril9. Videre kan immobilisering på en membran indusere conformational endringer i målet proteiner, noe som fører til forbedringer i tryptic fordøyelsen effektivitet10. Følgelig, i denne artikkelen, har vi beskrevet bruken av immunutfelling-LC/MS/MS analyse av protein interaksjoner med en on-membran fordøyelsen teknikk. Denne enkle metoden forenkler praktisk analyse av protein-protein interaksjoner selv i ikke-spesialist laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har tidligere beskrevet en analyse av oksidativt modifikasjoner av Apolipoprotein B-100 i oksidert lav tetthet lipoprotein ved hjelp av LC-MS/MS innledes med en on-membran fordøyelsen teknikk6. I den foreliggende studien kombinerte vi denne teknikken med immunutfelling og har identifisert flere calpain-6-assosierte proteiner. Denne romanen teknikken representerer en praktisk metode for screening for kandidat tilknyttede proteiner. Calpain-6 er et ikke-proteolytiske medlem av Calpain proteolyti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet delvis av Japan Society for fremme av science KAKENHI Grant Number 17K09869 (til AM), Japan Society for fremme av science KAKENHI Grant Number 15K09418 (til TM), et forskningsstipend fra Kanehara Ichiro Medical Science Foundation og et forskningsstipend fra Suzuken Memorial Foundation (alle til TM).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
