膜上消化技術を用いてのタンパク質・タンパク質相互作用の評価
Summary
ここでは、質量分析用サンプルの調製のための膜上消化技術のプロトコルを提示する。この技術は、タンパク質とタンパク質の相互作用の便利な分析を容易にします。
Abstract
多数の細胞内タンパク質は、細胞内および細胞外の状況に応じて物理的に相互作用します。実際、細胞機能は細胞内タンパク質とタンパク質の相互作用に大きく依存します。したがって、これらの相互作用に関する研究は、生理学的プロセスの理解を促進するために不可欠である。関連するタンパク質の共沈降、続いて質量分析(MS)分析により、新規なタンパク質相互作用の同定が可能になります。本研究では、タンパク質とタンパク質の相互作用の解析のための膜上消化と組み合わせた免疫沈殿-液体クロマトグラフィー(LC)-MS/MS解析の新しい技術の詳細を提供した。この技術は粗い免疫沈殿物のために適し、プロテオミクス分析のスループットを改善できる。タグ付けされた組換えタンパク質は、特定の抗体を使用して沈殿した。次に、ポリビニリデンジフッ化物膜片にブロットした免疫沈殿物を還元アルキル化を行った。トリプシン化後、消化されたタンパク質残元をLC-MS/MSを用いて分析し、この技術を用いて、いくつかの候補関連タンパク質を同定することができた。したがって、この方法は、新規タンパク質-タンパク質相互作用の特性化に便利で有用である。
Introduction
タンパク質は生物に構成的な役割を果たしますが、細胞内環境では継続的に合成、処理、分解されます。さらに、細胞内タンパク質は頻繁に物理的および生化学的に相互作用し、1、2、3の一方または両方の機能に影響を与える。例えば、真核陽子翻訳開始係数4A3(eIF4A3)を用いたスプライセオソーム関連タンパク質ホモロCWC22の直接結合は、エキソン接合複合体4の組み立てに必要である。これと一致して、CWC22に親和性を欠くeIF4A3変異体は、エキソン接合複雑駆動mRNAスプライシング4を容易にすることができない。したがって、タンパク質相互作用の研究は、生理的調節と細胞機能を正確に理解するために重要である。
近年の質量分析(MS)の進歩は、タンパク質とタンパク質の相互作用の包括的な分析に適用されている。例えば、内因性タンパク質または外因性に導入されたタグ付きタンパク質の同時沈殿を関連タンパク質と共に、MS分析に続いて、新規タンパク質相互作用5の同定を可能にする。しかし、MS/MS分析の主なボトルネックの1つは、タンパク質サンプルのトピプティックダイジェストからの回復が不十分である。細胞液分にプロテオミクス解析を行う場合、一般的にMS/MSサンプルを調製するために、インゲルおよび膜上消化技術が採用されています。我々は以前に、インゲル消化手順を膜上消化技術6と比較し、後者がより良い配列カバレッジに関連していることを示した。ポリビニリデン二フッ化物(PVDF)膜は、機械的に堅牢であり、高濃度の有機溶媒7、8に耐性があり、固定化された酵素消化を可能にするため、この目的に適している可能性があります。80%アセトニトリル9の存在下のタンパク質。さらに、膜上の固定化は、標的タンパク質の立体構造変化を誘発し、トリプティック消化効率10の改善につながる。そこで本稿では、膜上消化技術を用いてタンパク質相互作用の免疫沈殿-LC/MS/MS解析の使用について述べた。この簡単な方法は非専門の実験室でまた蛋白質の相互作用の便利な分析を促進する。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、以前に、オン膜消化技術6に先行するLC-MS/MSを用いた酸化低密度リポタンパク質におけるアポリポタンパク質B-100の酸化修飾の分析について説明した。本研究では、この技術を免疫沈殿と組み合わせ、いくつかのカルパイン-6関連タンパク質を同定した。この新しい技術は、候補関連タンパク質のスクリーニングの便利な方法を表す。Calpain-6は、そのタンパク質相互作…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、金原一郎医学財団の研究助成である日本学術振興会(AM)、日本学術振興会(TM)の一部で支援されました。そして、鈴研記念財団(すべてTM)からの研究助成金。
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
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