Summary

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Published: July 19, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

Abstract

חלבונים תאיים רבים אינטראקציה פיזית בהתאם לנסיבות תאיים שלהם מסחטות. אכן, פונקציות הסלולר תלוי במידה רבה חלבון תאיים – אינטראקציות חלבון. לכן, המחקר הנוגע לאינטראקציות אלו הוא הכרחי להקלה על הבנת התהליכים הפיזיולוגיים. שיתוף משקעים של חלבונים משויכים, ולאחריו ניתוח ספקטרומטר המסה (MS), מאפשר זיהוי אינטראקציות של חלבונים חדשניים. במחקר זה, סיפקנו את הפרטים של הטכניקה הרומן של immunoprecipitation-נוזלי כרומטוגרפיה (LC)-MS/MS ניתוח בשילוב עם העיכול על הקרום לניתוח של חלבון-אינטראקציות החלבון. טכניקה זו מתאימה לimmunoprecipitants גולמי ויכולה לשפר את התפוקה של ניתוחים פרוטאואריים. מתויג רקומביננטי חלבונים היו זירז באמצעות נוגדנים ספציפיים; בשלב הבא, immunoprecipitants מחק על החלקים הממבראני של הממברנה, שהיו חשופים לאלקיללציה. בעקבות טריסיזציה, משקעי החלבון המשועכלים נותחו באמצעות LC-MS/MS. באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לזהות מספר מועמדים משויכים חלבונים. כך, שיטה זו היא נוחה ושימושית לאפיון של החלבון הרומן – אינטראקציות חלבונים.

Introduction

למרות החלבונים לשחק תפקידים מחוקה באורגניזמים חיים, הם מסונתז ללא הרף, מעובד, ומושפל בסביבה תאיים. יתר על כן, חלבונים תאיים לעתים קרובות האינטראקציה פיזית ביולוגית, אשר משפיע על הפונקציה של אחד או שניהם1,2,3. לדוגמה, הכריכה הישירה של הומוCWC22 החלבון המשויך ל-איקריוטית באמצעות תרגום מסוג 4a3 (eIF4A3) הכרחית להרכבת מתחם הצומת אקסון4. בהתאם למצב זה, מוטציה eIF4A3 חסר אהדה עבור CWC22 נכשלת להקל על החדרת הצומת mRNA מונחה מורכבים מורכב של שחבור4. לפיכך, המחקר של אינטראקציות חלבונים הוא חיוני להבנה מדויקת של רגולציה הפיזיולוגית כמו גם של פונקציות סלולריות.

ההתקדמות האחרונה בספקטרומטר המסה (MS) הוחלו על הניתוח המקיף של אינטראקציות חלבונים בחלבון. למשל, שיתוף משקעים של חלבונים אנדוגני או אקסוגנבאופן ברור הציג חלבונים מתויגים עם החלבונים המשויכים שלהם, ואחריו ניתוח MS, מאפשר זיהוי של אינטראקציות החלבון הרומן5. עם זאת, בקבוק אחד גדול של ניתוח MS/MS הוא התאוששות ירודה מעיכול טריפטי של דגימות חלבון. עבור ניהול ניתוחים פרוטאומית על lysates תא, ב-ג’ל ושיטות עיכול על-ממברנה מועסקים בדרך כלל כדי להכין בדיקות MS/MS. בעבר השוונו הליך העיכול ב-ג’ל עם טכניקת העיכול6, והראה כי האחרון היה קשור כיסוי רצף טוב יותר. Pvc difluoride (pvdf) קרום עשוי להיות מתאים למטרה זו, כי היא חזקה מכנית עמידים בפני ריכוזים גבוהים של ממיסים אורגניים7,8, המתיר העיכול אנזימטי של קיבוע חלבונים בנוכחות 80% acetonitrile9. יתר על כן, השתק על קרום יכול לגרום לשינויים שינויים בחלבונים היעד, המוביל שיפורים ביעילות העיכול הטריפטי10. בהתאם לכך, במאמר זה, תיארנו את השימוש בניתוח immunoprecipitation-LC/MS/MS של אינטראקציות חלבונים באמצעות טכניקת העיכול על הממברנה. שיטה פשוטה זו מקלה על הניתוח הנוח של אינטראקציות חלבונים בחלבון גם במעבדות שאינן מתמחות.

Protocol

1. Immunoprecipitation הערה: השתמשנו במאגר הליזה שאינו נתרן dodecyl סולפט (SDS) ומשחרלי ציטראט, כפי שמתואר בסעיפים הבאים. עם זאת, השימוש בטכניקה immunoprecipitation חלופית בתוך הבית עשוי להיות גם ישים עבור הכנת דגימות LC-MS/MS. מעבר תאים מתורבתים עם וקטורים קידוד תג אפירופה לבד או חלבון פיוז’ן. עבור…

Representative Results

באמצעות ההליך הנ ל תיאר, immunoprecipitants נותחו באמצעות LC-MS/MS (איור 1). לאחר החרגה של חלבונים הנגזרים באופן שונה (חלבונים ממינים אחרים IgGs), 17 חלבונים זוהו calpain-6-הקשורים immunoprecipitants (שולחן 1) ו 15 חלבונים זוהו ב gfp הקשורים immunoprecipitants ( טבלה 2). של calpain-6 ו-GFP ?…

Discussion

בעבר תיארנו ניתוח של שינויים חמצוניים של אפוליפופרוטאין B-100 ב תחמוצת בצפיפות נמוכה ליפופרוטאין באמצעות LC-ms/ms לפניו על-ידי טכניקה העיכול הממברנה6. במחקר הנוכחי, אנו משולבים טכניקה זו עם immunoprecipitation וזיהה מספר calpain-6-הקשורים חלבונים. טכניקה זו מייצגת שיטה נוחה להקרנה עבור חלבונים …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה היה נתמך בחלק על ידי החברה היפן לקידום המדע KAKENHI גרנט מספר 17K09869 (כדי AM), יפן האגודה לקידום המדע KAKENHI גרנט מספר 15K09418 (ל TM), מענק מחקר מבית החולים Kanehara איצ’ירו המדע ומענק מחקר מקרן הזיכרון של סוזוקן (all-TM).

Materials

Acetonitrile Wako 014-00386
Citric acid Wako 030-05525
DiNA KYA Tech Co. nanoflow high-performance liquid chromatography
DiNa AI KYA Tech Co. nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler
DTT Nacalai tesque 14112-94
Dynabeads protein G Thermo Fisher Scientific 10003D
Formic acid Wako 066-00461
HiQ Sil C18W-3 KYA Tech Co. E03-100-100 0.10mmID * 100mmL
Iodoacetamide Wako 095-02151
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000008
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) Clontech 632380
NaCl Wako 191-01665
NH4HCO3 Wako 018-21742
Nonidet P-40 Sigma N6507 poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)
peptide standard KYA Tech Co. tBSA-04 tryptic digests of bovine serum albumin
PP vial KYA Tech Co. 03100S plastic sample tube
Protease inhibitor cooctail Sigma P8465
ProteinPilot software Sciex 5034057 software for protein identification
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111 trypsin
Sodium orthovanadate Sigma S6508
Sodium phosphate dibasic dihydrate Sigma 71643
TFA Wako 206-10731
trap column KYA Tech Co. A03-05-001 0.5mmID * 1mmL
TripleTOF 5600 system Sciex 4466015 Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer
Tris Wako 207-06275
Tween-20 Wako 160-21211

References

  1. Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
  2. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
  3. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
  4. Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
  5. Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
  6. Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
  7. Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
  8. Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
  9. Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
  10. Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
  11. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
  12. Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
  13. Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
  14. Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
  15. Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).

Play Video

Cite This Article
Obama, T., Miyazaki, T., Aiuchi, T., Miyazaki, A., Itabe, H. Evaluation of Protein–Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique. J. Vis. Exp. (149), e59733, doi:10.3791/59733 (2019).

View Video