여기에서 우리는 마우스 모형에 있는 혈액 단핵구의 화학전술 활동을 정량화하고, 혈액 단핵구에 영양, 약리학 및 유전 내정간섭의 효력을 평가하고 혈액 단핵구 파생된 대식세포특성화하기 위하여 프로토콜을 제시합니다 단핵구 화학 유도제 단백질-1 (MCP-1)을 사용하여 마우스 모델 – 로드 지하 막 유래 젤 플러그.
조직 항상성 및 수리는 단핵구 유래 대식세포의 모집에 크게 의존한다. 단핵구 유래 대식세포의 언더-및 과잉 모집은 상처 치유를 손상시킬 수 있습니다. 우리는 고지방 과 고당 식이요법이 단핵구 프라이밍과 기능 장애를 촉진하여 건강한 혈액 단핵구를 이형성 된 활성화 프로필과 손상된 표현형으로 대식세포로 분화 할 태세를 갖춘 하이퍼 화학 적 표현형으로 변환하는 것으로 나타났습니다. 가 소성. 단핵구 유래 대식세포의 과잉 모집 및 이형성 된 활성화 프로파일을 가진 대식세포의 모집은 대사 장애와 관련된 만성 염증성 질환의 발달에 중요한 기여가 될 것으로 여겨진다, 동맥 경화증과 비만을 포함. 이 프로토콜의 목적은 단핵구 프라이밍 및 기능 장애를 위한 바이오마커로서 혈액 단핵구의 화학활성을 정량화하고 대식세포 표현형 혈액 단핵구를 특성화하는 것이 이들 마우스 모델에서 분화될 태세이다. 단세포 서쪽 얼룩 분석을 사용하여, 우리는 마우스로 주입된 MCP-1 로드된 지하 막 유래 젤 플러그로 모집된 세포의 24 시간 33% 후에 단핵구 및 대식세포이다는 것을 보여줍니다; 58% 후 3. 그러나 5일째에는 단핵구와 대식세포 수가 현저히 감소했습니다. 마지막으로, 우리는 이 분석이 또한 외과로 회수된 지하 막 파생젤 플러그에서 살아있는 대식세포의 격리를 허용한다는 것을 보여주고, 그 후에 단 세포 서쪽 얼룩 분석에 의하여 후속 특성화를 복종될 수 있습니다.
단핵구 유래 대식세포의 모집은 동맥경화증 및 비만을 포함한 대사성 질환과 관련된 만성염증성 질환의 발병에 필수적이다 1,2,3, 4. 조직 손상 부위의 단핵구 유래 대식세포의 수와 가소성은 조직 항상성 및 수리에 매우 중요합니다. 단핵구 유래 대식세포의 미과및 과다 모집 모두 상처치유를 손상시킬 수 있습니다 5. 국소 조직 염증을 유발하는 것은 예를 들어, 대동맥 벽에 저밀도 지단백(LDL)의 축적 및 산화에 의해 또는 지방산 또는 세균성 리포폴리당산에 의한 지방세포의 염증 활성화에 의해 장내를 통해 누출되는 단핵구 화학유채 단백질-1(MCP-1/CCL2)과 같은 케모카인을 포함한 염증성 매개체의 방출을 유도한다. MCP-1은 C-C 케모카인 가문의 일원이며 조직 염증 및손상부위에 단핵구 유래 대식세포의 모집을 담당하는 주요 화학유채6, 7,8, 9,10. 혈관 내피의 염증 성 활성화는 세포 간 부착 분자 1 (ICAM-1) 및 혈관 세포 접착 분자 1 (VCAM-1)11,12,12와 같은 유착 분자의 발현을 초래합니다. MCP-1에 의해 활성화된 순환 단핵구는 단단히 부착하고 이어서 위전공간(12)으로이동한다. 침투 단핵구는 대식세포로 분화되어 전염증성 표현형으로 활성화되어 급성 염증 과정을 유도할 수 있습니다. 미세 환경에 의해 구동, 염증 성 대식 세포로 변환 할 수 있습니다, 이는 염증 세포의 제거에 중요한 역할을, 염증 성 신호를 제거하고 조직 복구 및 상처를 완료 치유12,13.
만성 대사 스트레스는 화학 적 매력과 증가 단핵구 모집에 극적으로 향상된 응답성을 위해 단핵구를 소수, 우리는 프라임 단핵구가 dysregulated 활성화 프로그램 및 양극화와 대식세포에 상승을 초래한다는 것을 보여주었습니다 상태14,15,16. 단핵구 프라이밍은 동맥 경화증, 비만 및 지방 간염, 신장 질환 및 암과 같은 대사 장애와 관련된 다른 만성 염증성 질환을 촉진합니다. 인간 질병의 마우스 모델에서 단핵구 프라이밍을 평가하고 정량화하기 위해, 우리는 생체 내 화학 활성을 측정하여 혈액 단핵구의 프라이밍 상태를 평가하는 새로운 기술을 개발했다14,15,16, 17. 우리의 접근은 화학유채로 적재된 지하 막 유래 젤의 주입을 관련시킵니다 – 우리는 일반적으로 MCP-1를 사용합니다 – 또는 마우스의 좌우 측면에 각각 차량을 사용합니다. 조심스럽게 피하주사할 때, 지하 막 유래 젤은 단일 플러그를 형성할 것이며, 이 로부터 케모카인은 주변의 대사 또는 염증 상태에 의해 영향을 받지 않는 정의된 화학전술 그라데이션을 확산시키고 생성할 수 있습니다. 또는 수신자 마우스.
우리가 우리의 분석에 사용하는 지하 막 유래 젤은 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 마우스 육종, 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질이 풍부한 종양에서 추출한 용해된 지하 막 제제입니다. 이 복잡한 단백질 혼합물에는 라미닌 (60 %), 콜라겐 IV (30 %), 브리징 분자 엔탁틴 (8 %) 및 여러 성장 인자를 포함합니다. 지하막 매트릭스 플러그 분석기는 원래 다양한 성장 인자18,19에반응하여 혈관신생을 조사하기 위해 개발되었다. 그러나, 단핵구 화학요법을 연구하기 위해서는 내피 세포 모집 및 혈관신생을 최소화하기 위해 성장 인자 고갈 된 지하 막 유래 겔을 사용하는 것이 중요합니다. Matrigel (지하 막 유래 젤이라고도 함)을 독특하고 특히 유용하게 만드는 것은 10 °C 이하의 온도에서 화학성분이 용해될 수 있다는 것입니다. 22 °C 이상의 온도에서 지하 멤브레인 유래 용액은 단계 전이를 빠르게 겪고 하이드로겔을 빠르게 형성합니다. 플러그는 간균 유래 중성 금속 loprotrotease로 외과적으로 절제, 세척 및 용해될 수 있으며, 이는 RNAeq, 단세포 RNA 및 기타 다양한 형광 활성화 세포 선별기(FACS)에서 분석할 수 있습니다. 오믹스 기술. 여기서 우리는 주사 후 1, 3 또는 5일 후에 지하 막 유래 겔 플러그로 모집된 세포 집단의 특성화에 대한 단세포 웨스턴 블롯 분석의 사용을 설명한다.
우리는 지하 막 파생 매트릭스의 독특한 물성과 화학으로이 독특한 매트릭스를로드하고 마우스에 주입 할 수있는 능력을 사용하여 생체 내 화학 요법 분석법을 개발했습니다. 이 분석법은 MCP-1에 대해 여기에 설명된 바와 같이 살아있는 마우스에서 단핵구(및 대식세포)의 반응성을 평가하고, 유전자 조작 또는 약리학, 식이 및 기타 환경 노출이 단핵구에 미치는 영향을 평가할 수 있게 해줍니다. 화학 요법. 우리가 이 마우스에서 만드는 chemokine 그라데이션은 유전, 약리학, 규정식 또는 환경 노출에 의해 본질적으로 영향을 받지 않습니다 때문에, 단핵구 화학 활성에 있는 변경은 실제로 이 단핵구에 있는 기능적인 변경을 반영하고, 우리가 보여주었듯이 이전에는 단백질 및 전사 수준 둘 다에서 재프로그래밍도17,20. 우리는 마우스에 있는 신진 대사 긴장이 화학력에 단핵구 반응을 증가시키고 이 hyper-chemotactic 활동이 증가한 단백질 S-glutathionylation, 가역적이고, 산화환원 의존적인 번역과 상관관계가 있다는 것을 보고했습니다 단백질 변형은 대부분의 경우 효소 및 단백질 기능 21,22의손실로 이어지며, 어떤 경우에는 단백질 분해를 촉진하기도한다 16,23.
이 절차를 성공적으로 실행하고 이 분석으로 최적의 결과를 얻으려면 지하 막 유래 용액의 정확한 부피가 천천히 주입되어 단수 의 잘 형성된 플러그및 섬유질 캡슐을 제거하는 것이 중요합니다. 완전히 수확 지하 막 유래 젤 플러그 때 깨끗한 플러그를 얻을, 디스파스 용액의 전체 플러그의 용해를 용이하게한다. 우리의 데이터는 3 일 동안 동물에 플러그를 남겨두는 것은 1) 신호 강도, 즉 각 플러그에 모집 된 단핵구 및 대식세포의 수, 2) 신호의 선택성, 즉 내의 단핵구 및 대식세포의 함량을 최적화한다는 것을 보여줍니다. 총 세포 집단 및 3) 신호의 특이성, 즉 차량에 비해 MCP-1에 대한 응답으로 단핵구 및 대식세포의 증가. 마지막으로, 우리는 지하 막 유래 젤 플러그 분석과 함께 최첨단 단일 세포 기반 접근법이 플러그에 모집 된 단핵구를 특성화하여 잠재적 인 표현형의 스냅 샷을 얻는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 특정 유전, 약리학, 식이 요법 또는 환경 적 개입에 대한 응답으로 주어진 마우스 모델에서 부상 부위에 모집되는 단핵구 유래 대식세포.
고려되어야 할 분석법의 여러 가지 제한사항이 있다. 첫째, 마취, 지하 막 유래 용액 의 주입 및 외과 용해를 포함한 마우스 처리는 단일 플러그 및 재현 가능한 데이터를 생성하는 연습이 필요합니다. 둘째, MCP-1 로 로드된 플러그로 모집된 대부분의 세포는 단핵구및 대식세포이지만, 상당수는 그렇지 않다. 이것은 이 세포 인구에 행한 그밖, 비 단세포 기지를 둔 분석 분석분석법의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, scWB를 위한 세포 용해 조건은 온화하기 때문에, 단백질의 이동 거리는 표준 WB와 다를 수 있고 단백질 크기와 상관관계가 없을 수 있습니다. 따라서, 세포 용해 및 실행 시간 둘 다 시험될 각각의 새로운 단백질및 사용된 각각의 1 차적인 항체에 대하여 검증되어야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트는 NIH (AT006885)에서 R.A.에 대한 보조금에 의해 지원되었다.
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |