הכמת של פעילות כימוכתית מונוציט בVivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים מונוציט

כל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה אושרו על-ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים בבית הספר לרפואה ביער התעוררות. 1. הכנת מקדם הצמיחה של MCP-1-מופחתת-ממברנה מרתף-פתרון נגזר הערה: . זה הליך סטרילי נקיון כיפה של תרבות התא עם חיטוי לפני הכנת קרום המרתף הפתרון הנגזר (למשל, מטריצות). להכין ארוז בנפרד סטרילי מזרק 1 מ ל ולנגב את החלק העליון של קרום המרתף הנגזר בקבוקון פתרון עם ספוגית אלכוהול לפני טעינת אותו לתוך המזרק. לחלוטין להפשיר את פקטור הצמיחה-מופחתת ממברנה המרתף הפתרון הנגזר על הקרח.זהירות: אם מטריצת קרום המרתף מופמסת בטמפרטורת החדר (RT), להבטיח חלקיקי קרח קטן נשאר כדי למנוע את הפתרון מפני הגלינג. לאחר הסדר, לפתוח את המבחנה לערבב MCP-1 או 1xPBS עם 0.1% BSA במכסה של תרבות התא. הכינו 1 מ ל של מזרק סטרילי עם מחט G 26 ו קריר על הקרח. הכנת פתרון מניות של MCP-1 על ידי המסת MCP-1 לריכוז הסופי של 50 μg/mL ב-1x PBS עם 0.1% BSA. לדלל MCP-1 ב 5 מ”ל מרתף קר ממברנה הפתרון הנגזר לריכוז הסופי של 500 ng/mL. הכינו כמות שווה של הפתרון הכולל של קרום המרתף עם הרכב בלבד (1x PBS מכילים 0.1% BSA). טען 500 μL של מרתף ממברנה הפתרון הנגזר (עם או בלי MCP-1) במזרק 1 mL. להסיר את כל בועות האוויר מן המרתף ממברנה נגזר הפתרון מזרק הטעון לפני ביצוע הזריקה כדי להבטיח מערך תקע אחיד. 2. הזרקת ממברנה במרתף-הפתרון הנגזר תרסיס 70% אתנול סביב אזור השגרה לפני ובמהלך הזריקות כדי לחטא את הסביבה. כדי לגרום להרדמה, למקם את העכבר בתא הרדמה ולהגדיר את מטר הזרימה2 כדי 1 ליטר/דקה ולאחר מכן להתאים את האידוי ל 2% isofהלביאן. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי ניטור קצב הנשימה (קצב/מזערי), רפלקס המצמוץ ותנועה של שפם. במהלך כל ההליך, לשמור על הרדמה באמצעות קונוס האף. במהלך ההליך להמשיך לעקוב אחר קצב הנשימה (קצב/מזערי), רפלקס הקרנית ותנועה של שפם כדי לוודא את עומק ההרדמה. לאחר אישור היעדר תגובה צביטה בבוהן, לאט להזריק (כ 100 μL/s) המרתף ממברנה הנגזר הפתרון תת-עורי לימין (אין MCP-1) ושמאלה (עם MCP-1) האגף של העכבר, בהתאמה. אם הזריקה איטית מדי, אטמי הקרום הנגזר מהממברנה עשויים להיות בעלי צורה אסימטרית, או אפילו מפוצלים, וקשה להסרה. להחזיק את המזרק עבור 20-30 s לאחר ההזרקה כדי למנוע את הדליפה של הפתרון וכלה לאפשר ליצור חלק ג’ל יחיד לטופס. לאחר ההזרקה, הצבת העכבר על משטח ההתחממות עם ניטור עד התאוששות. להחזיר את העכבר לכלוב המקורי פעם העכבר הוא התאושש לחלוטין. 3. בציר ממברנה מרתף-מצתים הנגזרים שוקלים שתי שפופרות נפרדות 1.5 mL עבור כל עכבר ולתייג אותם. שלושה ימים לאחר הזרקה של המרתף ממברנה הפתרון הנגזר, המתת החסד את העכבר בתא הרדמה באמצעות 3% isof, ואחריו פריקה צוואר הרחם. להסיר את הפרווה של העכבר באמצעות קוצץ שיער או להחיל קרם מסיר שיער עם מקלות משופעת כותנה עבור 5 דקות ולאחר מכן לנגב. החזק את העור העכבר באמצעות מלקחיים סביב בית החזה התחתון וחוליה המותני העליון ולעשות חתך 2 מ”מ לאורך העור. חותכים את קו האמצע של החלק האחורי של העכבר מתוך חתך שנעשו לחוליות צוואר הרחם עד 1 ס מ מעל הצומת חוליה caudal (הצומת הזנב) באמצעות מספריים כירורגי. הפרידו את העור משכבת השריר והצמד את העור על מצע פוליסטירן מוקצף. החזק בקפידה את הקפסולה הסיבית המכילה את התקע מרתף ממברנה נגזר ג’ל באמצעות מלקחיים עדינים ולהסיר את הקפסולה סיבי באמצעות מספריים עדינים כדי לנקות את התקע. הסר את המרתף מנוקה ממברנה הנגזרת ג’ל התקע והעבר אל 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה (ראה 3.1). שוקלים את שפופרת מיקרוצנטריפוגה עם התקע מרתף מנוקה המופק ג’ל ממברנה ולחשב את המשקל של התקע המרתף ממברנה נגזר ג’ל. 4. לעכל את קרום המרתף-מצתים הנגזרים הפשרת dispase 10 מ ל) על הקרח. הגון מרתף ממברנה הנגזרת ג’ל התקע בצינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות מספריים נקיים נקי. הוסף 800 μL של dispase לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה כל המכיל מרתף ממברנה הנגזרת ג’ל התקע. מערבולת עם מהירות מקסימלית 10 s לשבש את התקע. מודקות את הצינורות מיקרוצנטריפוגה עבור 2 h ב 37 ° c ב 1,400 rpm ב thermomixer כדי לפזר לחלוטין את התקע המרתף הנגזר ג’ל ממברנה. לאחר 2 h, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 10 דקות ב-RT. בזהירות להסיר ולמחוק את הסופרנטאנט. להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של 1x PBS ידי היפוך או הקשה. חזור על צנטריפוגה ב 200 x g עבור 10 דקות ב-RT. בזהירות להסיר ולמחוק את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה ב-300 μL של PBS. קח 50 μL של השעיית תאים בשפופרת מיקרוצנטריפוגה נפרדת. הוסף 0.5 μL של calcein AM (1 מ ‘) אל ההשעיה התא.הערה: Calcein אם הוא צבע ירוק הכדאיות של תא פלורסנט אשר מצטבר רק בתאי החיים. מודיית את התאים באינקובטור CO2 ב 37 ° c עבור 10 דקות. הרוזן פלורסנט ירוק (חי) ותאים שאינם פלורסנט (מת) באמצעות מונה תאים אוטומטי. 5. קביעת הרכב התא בהשעיה של תא באמצעות תא בודד (scWB) ניתוח מערבי מימה את שבב ה-scWB לפני השימוש ב-15 מ ל של מאגר ההשעיה של 1x בצלחת פטרי לפחות 10 דקות ב-RT. הוסף 1 מ ל של ההשעיה התא מדולל בודד (10000-100,000 תאים/mL) לשבב מחדש. הגדר את פני השטח בתחתית צלחת פטרי בגודל 10 ס מ. ודא שהמשטח מוגדר כשטוח. מכסים את צלחת פטרי עם מכסה כדי למנוע ייבוש ולתת לתאים להתיישב 5-15 דקות על ידי הדרגתי. מניחים את השבב תחת מיקרוסקופ שדה בהיר ולבדוק את הבארות בהגדלה 10x.הערה: כ 15-20% המיקרוגל צריך להיות מאוכלס על ידי תא בודד, פחות מ 2% של בארות צריך להכיל 2 או יותר תאים הטה את צלחת הפטרי בגודל 10 ס מ המכילה את השבב ב-45 מעלות. לשטוף את השבב עם מאגר ההשעיה של 1 x כדי להסיר תאים שנתפסו מפני השטח של השבב על ידי ליטוף עדין מלמעלה למטה של השבב. . אני חוזר 3 פעמים הכן את התא היחיד לכלי מערבי. קביעת זמן הפירוק, זמן האלקטרופורזה וזמן לכידת ה-UV. כדי לנתח את מקרופאגים ששוחזרו התאושש מתוך המרתף ממברנה נגזר התקע ג’ל, השתמש בהגדרות הבאות: זמן לפירוק: 0 s; זמן האלקטרופורזה: 160 s; לכידת UV זמן 240 s. לטעון בזהירות את השבב לתא האלקטרופורזה של תא יחיד הכלי המערבי, הפנים ג’ל צד. להשתמש בזהירות לא לפגוע בצד ג’ל של השבב. יוצקים את הליזה/הפעלת החוצץ לתוך החדר ומכסים לחלוטין את השבב המערבי של כל תא יחיד. הפעל את הפירוק התאים. הפעל כלי scWB באמצעות ההגדרה המפורטת ב-5.8. לאחר ההפעלה הושלמה, להעביר את השבב 10 ס מ צלחת פטרי ולשטוף את השבב פעמיים עם מאגר כביסה 1x עבור 10 דקות ב RT. הכנת דילול של נוגדן ראשוני (אנטי vinculin: 1:10; anti-CD45:1:15, אנטי CD11b: 1:20, anti-F4/80:1:10) בנפח כולל של 80 μL של נוגדן דילול (לערבב 8 μL של נוגדן 1 ועוד 8 μL של נוגדן 2 בתוספת 64 μL של דילול). הוסף 80 μL של פתרון הנוגדן העיקרי לחדר הבדיקה נוגדן והנמך את השבב ג’ל בצד למטה כך פתרון הנוגדן פתיל על פני השבב. דגירה עם פתרון הנוגדן העיקרי עבור 2 h ב RT. לשטוף את השבב שלוש פעמים עבור 10 דקות ב-1x מאגר כביסה על שייקר. לשטוף את השבב פעם במשך 10 דקות במים על השייקר לשפוך את הג. הכנת דילול 1:20 של נוגדן משני בנפח כולל של 80 μL (לערבב 2 μL של נוגדן משני בתוספת 78 μL של דילול). מודגנת את השבב עם נוגדן משני עבור 1 h ב RT מוגן מפני אור. לשטוף את השבב שלוש פעמים עבור 10 דקות עם מאגר כביסה 1x על שייקר. סובב את השבב באמצעות טווה שקופית כדי להסיר את כל מאגר הכביסה הנותר. סריקת השבב על סורק מיקרוarray לייזר כפול ברזולוציה של 5 יקרומטר בערוץ ספקטרלי של fluorophore מצמידים את הנוגדנים המשני. נתח נתונים באמצעות תוכנה ספציפית ל-scWB. 6. להפשיט את שבב scWB אחסן את השבב הסרוק במאגר הכביסה עד שהוא מוכן להתפשט. הניחו את מרחץ המים בתוך מכסה המנוע. מניחים מתלה צינור 50 mL באמבט המים עם המים רק 1 ס מ מעל הארון ומניחים את טמפרטורת המים ב-60 ° c. . הכן את מאגר החשפנות עבור 1 L של פתרון מאגר להתפשט, לפזר 9.85 g של טריס-HCl (pH 6.8) ו 20 גרם של SDS ב 900 mL של מים מזוקקים ולהתאים pH. ואז למלא עם מים מזוקקים ל 1L. הוסף 0.8% (v/v) של β-mercaptoethanol (β-ME; 14.3 M) מיד לפני כל שימוש. לאחר הסריקה הראשונית, מניחים את השבב בצלחת פטרי בגודל 10 ס מ לפני החשפנות. עבור כל שבב, לקחת 40 mL של להתפשט מאגר ולהוסיף 320 μl של β-ME.זהירות: β-ME הוא רעיל ומסוכן לאדם ולסביבה. ההליך הבא צריך להיעשות בתוך מכסה המנוע. הניחו את השבב במיכל ואטמו את המיכל בעזרת parafilm כדי למנוע דליפת מים למיכל. מניחים את המיכל בתוך מתלה הצינור באמבט המים שחומם מראש. מודטה עבור 90 דקות. הסירו בזהירות את השבב מהמיכל והניחו בצלחת פטרי טרייה. שטוף בקצרה את השבב פעם אחת עם מאגר שטיפת 1 x. ואז להוסיף 15 מ ל של מאגר כביסה 1x לצלחת פטרי. לשטוף את השבב עבור 15 דקות על שייקר. חזור על שלב השטיפה ארבע פעמים.הערה: שבב מוכן הנוגדן העיקרי הבא (ראה שלבים 5.12-5.21).