Summary

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

Published: May 21, 2019
doi:

Summary

פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ‘ אזורים לא מתורגמים (3 ‘ UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs הרגולציה קטנים אשר מזוהים לווסת מסלולים מסוימים של איתות תאיים במספר מחלות כולל סרטן. אלה RNAs הרגולציה קטנים בעיקר אינטראקציה עם 3 ‘ אזורים לא מתורגם (3 ‘ UTR) של שליח היעד שלהם RNAs (mRNAs) בסופו של דבר וכתוצאה מכך עיכוב תהליכי פענוח של mRNAs ואת הגדלת Mrnas היעד degradations. בהתבסס על רמות הביטוי ופונקציות תאיים, miRNAs מסוגלים לשמש גורמי רגולציה של mRNAs ומדכאים הגידול המדכא. זיהוי של גנים היעד בתום המטרה של miRNA בין מאות או אפילו אלפי מטרות חזוי מבחינה חישובית הוא צעד מכריע כדי להבחין את התפקידים ומנגנונים מולקולאריים בסיסיים של מירנה של עניין. תוכניות מסוימות לחיזוי היעד miRNA זמינים כדי לחפש אינטראקציות miRNA-mRNA אפשרי. עם זאת, השאלה המאתגרים ביותר היא כיצד לאמת גנים מטרה ישירה של miRNA עניין. פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה הניתן לפונקציה של שיטות מפתח כיצד לזהות יעדי miRNA הקשורים לפונקציה miRNA. פרוטוקול זה מציג מדריך מעשי על הליכים צעד אחר צעד כדי לחשוף רמות miRNA, פונקציות, ו-mRNAs הקשורות היעד באמצעות הבדיקה מבוסס בזמן אמת התגובה שרשרת פולימראז (PCR), sulforhodamine B (SRB) שיטת בעקבות מחקה מחקים העברה , מינון התגובה עקומת הדור, ושיטת לוציפראז יחד עם שיבוט של 3 ‘ UTR של גן, אשר הכרחי להבנה נכונה של התפקידים של miRNAs בודדים.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs הרגולציה קטן כי בעיקר לווסת את תהליך התרגום והשפלה של RNAs שליח (mRNAs) על ידי התגובה ל 3 ‘ אזורים לא מתורגם (3 ‘ UTR) בתום היעד לאחד גנים1. ביטוי של miRNAs יכול להיות מוסדר על ידי מנגנונים שלאחר ההמרה. חוסר האיזון של מנגנונים כגון מביא בלתי מבוקרת וייחודית רמות הביטוי miRNAs במחלות רבות כולל סרטן2. ל-miRNA אחת יכול להיות מספר אינטראקציות עם mRNAs מגוונות. בהתאמה, mRNA הפרט יכול להיות נשלט על ידי miRNAs שונים. לכן, רשתות איתות תאיים מושפע באופן מסובכת על ידי ביטוי באופן מתבטא על ידי הפרעות פיסיולוגיים ומחלות ניתן ליזום והידרדר2,3,4, מיכל 5 , 6. למרות הביטוי השונה של mirnas נצפתה סוגים שונים של סרטן, המנגנונים המולקולריים לווסת את הנימוסים של תאים סרטניים בשילוב עם mirnas עדיין לא ידוע ברובו.

צבירת ראיות הראה כי התפקידים אונגניים או מדכאים הגידול של miRNAs תלוי בסוגי סרטן. לדוגמה, על-ידי פילוח forkhead box o3 (FOXO3), מיר-155 מקדם את התפשטות התא, גרורות, ו-cheמורשת של סרטן המעי הגס7,8. לעומת זאת, ההגבלה של הפלישה התאים glioma נגרמת על ידי מיר-107 באמצעות התקנה של חלבון מקור נוירוגניים הומולוג 2 (NOTCH2) ביטוי9. הערכה של האינטראקציות miRNA-target בקשר עם פונקציות miRNA הוא חלק הכרחי כדי להבין טוב יותר כיצד Mirna לווסת תהליכים ביולוגיים שונים במדינות בריאות וחולה10. בנוסף, הגילוי של היעד בתום האדם (s) של miRNAs יכול עוד לספק אסטרטגיה מכוון עדין עבור טיפול מבוסס Mirnas עם תרופות נגד סרטן שונים. עם זאת, האתגר העיקרי בתחום של miRNAs הוא זיהוי של יעדים ישירים של miRNAs. כאן, שיטות מפורטות מוצגים כגישות ניסיוני לצורך הגדרה גנטית היעד miRNA. תכנון ניסיוני מוצלח עבור זיהוי יעד miRNA כרוך בשלבים שונים ושיקולים (איור 1). השוואה של רמות miRNA בוגרת בתאי הגידול תאים נורמליים יכול להיות אחד ההליכים השכיחים כדי לבחור miRNA עניין (איור 1A). המחקר הפונקציונלי של miRNA שנבחרו כדי לזהות את ההשפעות של miRNA על התפשטות התא חשוב לצמצם את רשימת המטרות המועמדים הפוטנציאליים הטובים ביותר של miRNA עניין (איור 1B). מבוסס על פונקציות מאומת הניסויים של miRNAs, סקירה שיטתית של ספרות ומסד נתונים בחברה עם תוכנית חיזוי יעד Mirnas נדרש כדי לחפש את המידע הרלוונטי ביותר על פונקציות גן (איור 1C). הזיהוי של גנים היעד האמיתי של mirna העניין יכול להיות מושגת על ידי יישום ניסויים כגון שיטת ללוציפראז יחד עם שיבוט של 3 ‘ utr של גן, PCR בזמן אמת, ו בלוק מערבי (איור 1d). המטרה של הפרוטוקול הנוכחי היא לספק שיטות מקיפות של ניסויים מרכזיים, את תגובת שרשרת פולימראז מבוסס בזמן אמת (PCR), sulforhodamine B (SRB) שיטה בעקבות מחקים miRNA מחקה, מינון תגובה הדור עקומת, ו שיטת לוציפראז יחד עם שיבוט של 3 UTR של גן. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות שימושי להבנה טובה יותר של הפונקציות של miRNAs בודדים ואת המשמעות של Mirnas בטיפול בסרטן.

Protocol

1. ניתוח ביטוי מיקרו-מיקרוארנה (מירנא) בוגרת DNA משלימה (cDNA) סינתזה להוסיף 254 ng בסך הכל RNA ו 4.5 μl של deoxyribonuclease אני (dnase i) תערובות, ולאחר מכן להוסיף מים אלקטרופורזה ל-PCR רצועת צינורות לפצות עד 18 μl (איור 2a). הכן את התגובה עבור כל מדגם RNA הכולל מטוהרים ממספר קווי תאי?…

Representative Results

אישור מוצלח ומדויק של רמות miRNA חשוב לפרשנות של הנתונים שבהם הסיווג של Mirna אפשרי מבוסס על התפקידים הצפויים של Mirna בפיתוח והתקדמות של מחלה. רמות של miRNA-107 ו miRNA-301 נמדדו שלושה קווי התא הלבלב באמצעות ה-PCR כמותי המבוסס על בדיקה. סינתזה של cDNAs הן של miRNA ספציפית ו גן התייחסות באותה תגובה יכולה להגביר את…

Discussion

אסטרטגיות לקביעת מטרות miRNA בתום ובלבד עם פונקציות של מירנה של עניין הם חיוניים להבנת תפקידים מרובים של Mirna. זיהוי של גנים היעד miRNA יכול להיות מנחה לפענוח התא איתות אירועים מאופנן על ידי Mirna בתא. החשיפה של גנים מטרה חשובה מבחינה פונקציונלית של miRNAs יכול לספק את הידע הבסיסי לפתח טיפול מבוססי Mirna…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית בסיסית מחקר המדע באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2017R1D1A3B03035662); הקרן לחקר האוניברסיטה, 2017 (HRF-201703-003).

Materials

15 mL conical tube SPL Life Sciences 50015
24-well plate Thermo Scientific 142475
50 mL conical tube SPL Life Sciences 50050
6-well plate Falcon 353046
6X DNA loading dye Real Biotech Corporation RD006 1 mL
8-cap strip Applied Biosystems N8010535 For cDNA synthesis
8-tube strip Applied Biosystems N8010580 For cDNA synthesis
96-well plate Falcon 353072
Acetic acid Sigma A6283-1L 1 L
Agarose A Bio Basic D0012 500 g
Alkaline phosphatase New England Biolabs M0290S 10,000 U/mL
Ampicillin Bio basic Canada Inc AB0028 25 g
AriaMx 96 tube strips Agilent Technologies 401493 For real time PCR
AriaMx real-time PCR system Agilent Technologies G8830A qPCR amplification, detection, and data analysis
AsiSI New England Biolabs R0630 10,000 units/mL
CAPAN-1 cells ATCC HTB-79
Cell culture hood Labtech Model: LCB-1203B-A2
Counting chambers with V-slash Paul Marienfeld 650010 Cells counter
CutSmart buffer New England Biolabs B7204S 10X concentration
DMEM Gibco 11965-092 500 mL
DNA gel extraction kit Bionics DN30200 200 prep
DNA ladder NIPPON Genetics EUROPE MWD1 1 Kb ladder
DNase I Invitrogen 18068015 100 units
Dual-luciferase reporter assay system Promega E1910 100 assays
Fetal bovine serum Gibco 26140-079 500 mL
HIT competent cells Real Biotech Corporation(RBC) RH617 Competent cells
HPNE cells ATCC CRL-4023
LB agar broth Bio Basic SD7003 250 g
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 0.75 mL
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-075 0.75 mL
Luminometer Promega Model: E5311
Microcentrifuge tube Eppendorf 22431021
Microplate reader TECAN Infinite F50
miRNA control mimic Ambion 4464058 5 nmole
miRNA-107 mimic Ambion 4464066 5 nmole
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 50 prep
Mupid-2plus (electrophoresis system) TaKaRa Model: AD110
NotI New England Biolabs R3189 20,000 units/mL
Oligo explorer program GeneLink For primer design
Optical tube strip caps (8X Strip) Agilent Technologies 401425 For real time PCR
Opti-MEM Gibco 31985-070 500 Ml
PANC-1 cells ATCC CRL-1469
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122 100 mL
Phosphate buffer saline Gibco 14040117 1000 mL
Plasmid DNA miniprep S& V kit Bionics DN10200 200 prep
PrimeSTAR GXL DNA polymerase TaKaRa R050A 250 units
Shaker TECAN Shaking platform
Shaking incubator Labtech Model: LSI-3016A
Sigmaplot 14 software Systat Software Inc For dose-response curve generation
Sulforhodamine B powder Sigma S1402-5G 5 g
SYBR green master mix Smobio TQ12001805401-3 Binding fluorescent dye for dsDNA
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A 25,000 U
TaqMan master mix Applied Biosystems 4324018 200 reactions, no AmpErase UNG
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan miR RT kit Applied Biosystems 4366597 1000 reactions
Thermo CO2 incubator (BB15) ThermoFisher Scientific 37 °C and 5% CO2 incubation
Trichloroacetic acid Sigma 91228-100G 100 g
Trizma base Sigma T4661-100G 100 g
Ultrapure water Invitrogen 10977-015 500 mL
Veriti 96 well thermal cycler Applied Biosystems For amplification of DNA (or cDNA)
XhoI New England Biolabs R0146 20,000 units/mL

References

  1. He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
  2. Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  3. Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
  4. Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
  5. Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
  6. Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
  7. Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
  8. Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
  9. Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
  10. Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
  11. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
  12. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
  16. Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
  17. Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
  18. van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
  19. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
  20. Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
  21. Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
  22. Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
  23. Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
  24. Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
  25. Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
  26. Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
  27. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
  28. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
  29. Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
  30. Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
  31. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  32. Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
  33. Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
  34. Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. 암 연구학. 70 (2), 440-446 (2010).
  35. Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).

Play Video

Cite This Article
Seo, H. A., Hwang, C. Y., Moeng, S., Park, J. K. An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells. J. Vis. Exp. (147), e59628, doi:10.3791/59628 (2019).

View Video