Summary

Ensayo in vitro transcrito luciferase Reporter basado en ARN para estudiar el Reglamento de traducción en las células infectadas por el poxvirus

Published: May 01, 2019
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Summary

Presentamos un protocolo para estudiar la regulación de la traducción de mRNA en células infectadas por poxvirus usando el ensayo de reportero de luciferasa transcrito in vitro basado en ARN. El ensayo se puede utilizar para estudiar la regulación de la traducción por CIS-Elements de un mRNA, incluyendo 5 ‘-región no traducida (UTR) y 3 ‘-UTR. También se pueden examinar diferentes modos de iniciación de la traducción utilizando este método.

Abstract

Cada poxvirus mRNA transcrito después de la replicación del ADN viral tiene un líder de 5 ‘-Poly (A) evolutivamente conservado, no con plantilla en el 5 ‘-UTR. Para diseccionar el papel de 5 ‘-Poly (A) líder en la traducción de mRNA durante la infección por el poxvirus desarrollamos un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa. Este ensayo de reportero consta de cuatro pasos principales: (1) PCR para amplificar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro; (2) transcripción in vitro para generar ARNm utilizando la polimerasa de T7 RNA; (3) transfección para introducir in vitro el mRNA transcrito en las células; (4) detección de la actividad luciferasa como indicador de la traducción. El ensayo de la reportera luciferasa basado en ARN descrito aquí elude los problemas de la replicación plásmia en las células infectadas por el poxvirus y la transcripción críptica del plásmido. Este protocolo se puede utilizar para determinar la regulación de la traducción por CIS-Elements en un mRNA que incluye 5 ‘-UTR y 3 ‘-UTR en sistemas que no sean células infectadas por el poxvirus. Por otra parte, diferentes modos de iniciación de la traducción como dependiente de la PAC, Cap-independiente, re-iniciación, y la iniciación interna se pueden investigar utilizando este método.

Introduction

Según el dogma central, la información genética fluye del ADN al ARN y finalmente a la proteína1,2. Este flujo de información genética está altamente regulado en muchos niveles, incluyendo la traducción de mRNA3,4. El desarrollo de ensayos de reportera para medir la regulación de la expresión génica facilitará la comprensión de los mecanismos regulatorios involucrados en este proceso. Aquí describimos un protocolo para estudiar la traducción de mRNA usando un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa en células infectadas con poxvirus.

Los poxvirus comprenden muchos patógenos humanos y animales altamente peligrosos5. Como todos los demás virus, los poxvirus dependen exclusivamente de la maquinaria de célula huésped para la síntesis de proteínas6,7,8. Para sintetizar eficientemente las proteínas virales, los virus desarrollaron muchas estrategias para secuestrar la maquinaria celular translacional para redirigirla para la traducción de mRNAs virales7,8. Un mecanismo comúnmente empleado por virus es utilizar elementos de acción CISen sus transcripciones. Algunos ejemplos notables son el sitio de entrada ribosome interno (IRES) y el potenciador de la traducción independiente de la PAC (CITE)9,10,11. Estos elementos CIShacen de las transcripciones virales una ventaja traslacional al atraer maquinaria traslacional a través de diversos mecanismos12,13,14. Más de 100 mRNAs de poxvirus tienen un elemento de acción CISevolutivamente conservado en la región 5 ‘-no traducida (5 ‘-UTR): un 5 ‘-poli (a) líder en los 5 ‘ extremos de estos mRNAs15,16. Las longitudes de estos 5 ‘-Poly (A) líderes son heterogéneos y se generan por el deslizamiento de la polimerasa del arn codificado con poxvirus durante la transcripción17,18. Nosotros, y otros, recientemente descubrimos que el 5 ‘-poli (A) líder confiere una ventaja de traducción a un mRNA en las células infectadas con el virus vaccinia (VACV), el miembro prototypic de poxvirus19,20.

El ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa se desarrolló inicialmente para entender el papel del líder 5 ‘-Poly (A) en la traducción de mRNA durante la infección por poxvirus19,21. Aunque los ensayos de reportero de luciferasa basados en ADN plásmido han sido ampliamente utilizados, hay varios inconvenientes que complicarán la interpretación de resultados en las células infectadas por el poxvirus. En primer lugar, los plásmidos son capaces de replicar en las células infectadas por VACV22. En segundo lugar, la transcripción críptica a menudo ocurre a partir del ADN plásmido18,23,24. En tercer lugar, la transcripción impulsada por el promotor de VACV genera Poly (A)-líder de longitudes heterogéneas por lo que dificulta el control de la longitud del líder Poly (a) en algunos experimentos18. Un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa que evita estos problemas y la interpretación de los datos es sencilla.

Hay cuatro pasos clave en este método: (1) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro; (2) transcripción in vitro para generar mRNA; (3) transfección para entregar mRNA en las células; y (4) la detección de la actividad luciferasa como indicador de la traducción (figura 1). El amplificador de PCR resultante contiene los siguientes elementos en la dirección 5 ‘ a 3 ‘: T7-Promoter, líder Poly (A) o la secuencia deseada de 5 ‘-UTR, luciferasa Firefly con marco de lectura abierta (ORF) seguida de una cola Poly (A). El amplicón de PCR se utiliza como la plantilla para sintetizar mRNA por transcripción in vitro usando la T7 polimerasa. Durante la transcripción in vitro, m7G Cap u otro análogo de la tapa se incorpora en el mRNA recién sintetizado. Las transcripciones coronadas se transfectadas en células no infectadas o infectadas por VACV. El lisado celular se recoge en el momento deseado después de la transfección para medir las actividades de luciferasa que indican la producción de proteínas del mRNA transfeccionado. Este ensayo reportero se puede utilizar para estudiar la regulación de la traducción por CIS-Element presente en 5 ‘-UTR, 3 ‘-UTR u otras regiones de un mRNA. Además, el ensayo in vitro transcrito basado en ARN puede utilizarse para estudiar diferentes mecanismos de iniciación de la traducción, incluyendo iniciación dependiente de la PAC, iniciación independiente de la tapa, reiniciación e iniciación interna como IRES.

Protocol

1. preparación de la plantilla de ADN por PCR para la transcripción in vitro Para preparar la plantilla de ADN mediante PCR, diseñe imprimadores. Al diseñar imprimaciones considerar características cruciales como la longitud de imprimación, temperatura de recocido (Tm), contenido GC, 3 ‘ end con G o C, etc.Nota: Discutidos detalladamente en esta literatura25,26,27….

Representative Results

Los cuatro pasos del ensayo in vitro transcrito de la luciferasa basada en ARN: la PCR para generar una plantilla de ADN para la transcripción in vitro, la transcripción in vitro para generar ARNm, la transfección de mRNA y la medición de luciferasa, se pueden ver en el diagrama esquemático ( Figura 1). El diseño de imprimadores para ambas plantillas de ADN (FLUC y Rluc) y el esquema general de PCR de extensión de voladizo se ilustra en el esquema (<st…

Discussion

Todos los pasos de cuatro núcleos son fundamentales para el éxito del ensayo de reportero de luciferasa, basado en ARN transcrito in vitro. Se debe prestar especial atención al diseño de imprimación, especialmente para la secuencia de promotor T7. La polimerasa de T7 RNA comienza la transcripción de la primera G (gGG-5′-UTR-Aug-) subrayada en T7 promotor añadida antes de la secuencia 5 ‘-UTR. Aunque el sitio de inicio de la transcripción (TSS) comienza a partir de la primera G en el extremo 5 ‘, la disminu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El proyecto fue financiado por los institutos nacionales de la salud (AI128406 www.nih.gov) a la ZY y en parte por el centro de investigación del cáncer de Johnson (http://cancer.k-state.edu) en forma de postgrado estudiante verano Stipend a PD.

Materials

2X-Q5 Master mix New England Biolabs M0492 High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs S1411L Anti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate Corning 3693 Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1960 Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit OMEGA BIO-TEK D6492 PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate Luminometer Promega GM2010 Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit New England Biolabs E2050S In-Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019 Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000 Thermo Fisher Scientific ND-2000 Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985070 Reduced serum media
Purelink RNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific 12183018A RNA purification kit
Vaccinia Capping System New England Biolabs M2080 Capping system

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Cite This Article
Dhungel, P., Cantu, F., Hernandez, C., Yang, Z. In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells. J. Vis. Exp. (147), e59626, doi:10.3791/59626 (2019).

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